ХОЧУШКИНА БОЛТУШКА - 32

[Casablanca 1]

Алло, это аист? Скорей прилетайте:
Мы ждем не дождёмся которые сутки!
Несите сюда. Никому не отдайте
Конверт с долгожданной любимой малюткой!

Мы готовимся стать МАМОЙ
(или как правильно подойти к планированию)

С чего начать

Итак, вы решили, что пора стать мамой. Впереди девять месяцев трепетного ожидания, ритуал выбора имени, удовольствие от походов по магазинам детских товаров… Для того чтобы беременность прошла гладко и безмятежно, к ней необходимо подготовиться заранее, соблюдая ряд несложных, но очень важных правил.
Шаг 1
Не секрет, что беременность – крайне важный этап в жизни каждой женщины, и необходимо убедиться в том, что организм действительно готов к процессу зачатия, вынашивания и родов. Ряд последовательных шагов приведет вас к исполнению мечты о рождении здорового малыша.
Прежде всего, Вам предстоит посетить ряд специалистов, таких как:
терапевт: врач Вас осмотрит, измерит артериальное давление, назначит флюорографию, анализы крови и мочи;
гинеколог: после осмотра врач даст вам направление на сдачу необходимых анализов, направит на УЗИ малого таза;
стоматолог: во время беременности лечение зубов с применением анестезии и рентгеновских снимков нежелательно, так что все проблемы с зубами лучше решить до зачатия;
профильный специалист по тем или иным заболеваниям: если вы наблюдаетесь у флеболога, эндокринолога или, например, кардиолога, при планировании беременности обязательно посоветуйтесь и с этим врачом.
В некоторых случаях перед зачатием необходима консультация медицинского генетика. Как правило, такая необходимость возникает для будущих мам старше 35 лет и в том случае, если у кого-то из родственников будущих родителей есть генетическая патология.
Шаг 2 - АНАЛИЗЫ:
1.Общий анализ мочи
2.Общий анализ крови (развернутый)
3.Биохимический анализ крови
4. Коагулограмма (оценивает свертывающую систему крови)
5.Определение группы крови и резус фактора обоих!!! супругов
6.Анализ крови на TORCH-инфекции с титром при наличии антител (антитела к вирусу краснухи, токсоплазмы, герпесу первого и второго типа, цитомегаловирусу)
7. Анализ крови на ВИЧ, гепатиты В и С, сифилис
8. Анализ на скрытые инфекции, предающиеся половым путем (уреаплазмоз, хламидиоз, гарднерелез, кандидоз, микоплазмоз, гонорея, трихоманиаз, вирус паппиломы человека и др.)
9. При необходимости анализ на гормоны (Т3, Т4, ТТГ, Т3свободный, ФСГ, ЛГ, пролактин, эстрадиол, прогестерон, тестостерон и др по назначению врача)
И если вы и ваш партнер здоровы, то долой все запреты и вперед к счастливому беременному будущему))))))))))))))))

АНАЛИЗЫ и все о них!

Общий анализ мочи

.......

....

Вопросы РЕПРОДУКТОЛОГИИ

Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ:

Боярский КЮ, Гайдуков СН, Пальченко Н.А.
Информация об авторах:
Резюме: Имплантация человеческого эмбриона остается последним, не взятым барьером на пути повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий. В настоящее время нет четких маркеров, могущих определить рецептивность эндометрия. В литературе нет четкого единого определения, при какой толщине эндометрий можно считать тонким. Современные исследования показывают, что в программе донации ооцитов частота наступления беременности не зависит от толщины эндометрия и эндометрий толщиной 7 и даже 6 мм можно считать приемлемым для осуществления переноса. В то же время при овариальной стимуляции в программе ЭКО/ИКСИ минимально приемлемой толщиной эндометрия стоит считать, согласно современным литературным данным, 7 или 8 мм. Наличие атрофического эндометрий, толщиной 5 мм и менее, в любом случае связан с плохим прогнозом при переносе эмбрионов. Предложенные методы повышения толщины эндометрия в программах ВРТ должны найти дальнейшее подтверждение исследованиями, проведенными методами доказательной медицины.
Ключевые слова: рецептивность эндометрия, тонкий эндометрий. Донация ооцитов, циклы ЭКО/ИКСИ
Тонкий эндометрий остается противоречивой проблемой при применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В литературе отсутствует общепризнанный подход, как к определению понятия тонкого эндометрия, так и к путям, ведущим к решению этой проблемы. Проблема тонкого эндометрия тесным образом связана с имплантацией человеческого эмбриона.
В декабре 2006 года в Королевском обществе акушеров и гинекологов (Лондон) лауреат Нобелевской премии Роберт Эдвардс (1925-2013) прочитал одну из своих последних лекций под названием «Имплантация человеческого эмбриона: последний барьер ВРТ?» (1).В этой лекции, которая является своего рода завещанием ученого, профессор Эдвардс показал, что большинство проблем стоявших изначально перед репродуктивной медициной и применением методик ВРТ успешно решены. В настоящее время специалисты в области репродукции человека достаточно просто решают такие задачи, как контролируемая овариальная стимуляция, забор фолликулов и получение ооцитов под контролем вагинального датчика УЗИ, перенос эмбрионов осуществляется с помощью специальных катетеров, назначение препаратов прогестерона и ХГЧ успешно решает проблему поддержки лютеиновой фазы в программах ВРТ. В области эмбриологии и генетики достигнут впечатляющий прогресс. Разработаны и успешно применяются методики оплодотворения ооцитов человека, как с помощью обычной методики ЭКО, как и с помощью ИКСИ. Разработаны среды для успешного культивирования эмбрионов вплоть до пятого дня. Все успешно развивающиеся эмбрионы, которые не пересажены в полость матки в протоколе стимуляции, могут быть заморожены и после оттаивания успешно пересажены пациентке в последующих циклах. В области преимплантационной генетики применяется анализ направительных телец, бластомеров эмбрионов на стадии дробления и клеток трофоктодермы на предмет наличия нормального числа хромосом в развивающихся эмбрионах. Также используется преимплантационная диагностика для выявления заболеваний в клетках эмбрионов, полученных от родителей носителей различных генетических мутаций. Однако, несмотря на эти грандиозные успехи, вероятность родов при расчете на перенос одного эмбриона, даже в идеальных условиях не превышает 25-30% (2,3). Это связано, во-первых, с низкой вероятностью зачатия и родов у человека, которая у здоровых женщин 19-26 лет, при регулярной половой жизни, не превышает 55% в расчете на один менструальный цикл (4). Во-вторых, основной проблемой остается отсутствие имплантации при пересадке эмбриона хорошего качества в полость матки. По расчетам специалистов, на отсутствие имплантации приходится 70% причин неудач в программах ЭКО. Ведущую роль в процессе имплантации занимает так называемая рецептивность эндометрия, т.е. способность последнего обеспечить необходимые этапы имплантации: ориентацию бластоцисты в полости матки относительно места будущей имплантации, адгезию на поверхности эндометрия и инвазию (внедрение) в полость матки. Также исследователями было разработано понятие «окна имплантации», т.е. небольшого промежутка времени (обычно не превышающего одного – двух суток), в течение которого человеческая бластоциста может внедриться в полость матки с образованием беременности, которая может успешно развиваться до родов. В любое другое время эндометрий не является рецептивным, т.е. успешная имплантация эмбриона невозможна. Учитывая, то, что у человека может возникать внематочная беременность, как в фаллопиевой трубе, так и на поверхности брюшины или яичника окно имплантации в эндометрии является важным фактором, определяющим показатели фертильности у человека и несет определенные функции, связанным с ограничением вероятности зачатия. Другими словами у человека успешная беременность четко связана с имплантацией бластоцисты в эндометрий в очень ограниченное время, и успешная беременность невозможна в другом месте и в другое время. Изучение имплантации человеческого эмбриона является важнейшей задачей современной медицины и проблема повышение вероятности имплантации является последним не преодоленным барьером на пути развития ВРТ(1).
Изучение эндометрия в период имплантации началось более 60 лет назад, когда американские исследователи четко описали секреторные изменения и эдему, максимум которых приходится на 7 день лютеиновой фазы цикла (5). К сожалению, одно только гистологическое исследование не дает представление о рецептивности эндометрия и скорее свидетельствует о произошедшей в данном менструальном цикле овуляции.
Дальнейшие исследования рецептивности эндометрия были связаны с изучением рецепторов эстрогенов и прогестерона в клетках эпителия и стромы эндометрия в период имплантации. Было выяснено, что вначале секреторной фазы цикла (на 16 день идеального менструального цикла в 28 дней) в клетках эпителия и стромы эндометрия наблюдается большое количество рецепторов эстрогенов и прогестерона, тогда как к 20 – 22 дню цикла, которое считается временем имплантации бластоцисты, эти рецепторы в клетках эпителия полностью исчезают, тогда как их количество в клетках стромы остается крайне высоким. Интересно отметить, что исчезновение рецепторов в клетках эпителия совпадает с самыми высокими уровнями эстрадиола и прогестерона в крови женщины в течении менструального цикла. Исследователи считают, что именно резкое падение рецепторов к эстрогенам и прогестерону в клетках эпителия вызывает появление на поверхности этих клеток белков клеточной адгезии (интегринов), а также увеличивает чувствительность к факторам роста, выделяемых клетками стромы эндометрия (6).
За последние годы интерес к проблеме рецептивности эндометрия остается высоким, и были предложены ряд новых маркеров окна имплантации. Одним из этих маркеров было появление на эндометрии в середине лютеиновой фазы пиноподий. Пиноподии, выросты на поверхности эндометрия (около 5 нм в диаметре) были обнаружены в период, совпадающий с окном имплантаци с помощью электронной микроскопии у ряда млекопитающих, таких как крыса и человек (7). Физиологическое значение развития пиноподий до конца не понятно, однако есть ряд доказательств, что именно на поверхности пиноподий происходят начальные этапы адгезии (прикрепления) бластоцисты к рецептивному эндометрию (8). Были предприняты ряд исследований, с целью изучения особенности формирования пиноподий у пациенток в различных клинических ситуациях. Выяснилось, что в естественном цикле, образование пиноподий начинается с пятого дня после овуляции и достигает максимума на седьмой день, после чего пиноподии исчезают в течение двух суток. При овариальной стимуляции образование пиноподий начинается на четвёртый день после назначения ХГЧ и пика достигает на шестые сутки, после чего количество пиноподий резко падает. В циклах гормон заместительной терапии, применяемой в программах переноса замороженных эмбрионов и в программах донации ооцитов пиноподии появляются на седьмой день после назначения прогестерона и их количество резко возрастает на восьмой день после чего резко их количество резко падает. Эти данные говорят о возможном смещение окна имплантации в циклах с овариальной стимуляцией, что может объяснять уменьшение вероятности имплантации в этих циклах по сравнению с естественными циклами, или циклами с применением гормон-заместительной терапии (9). Однако стоит отметить, что попытки внедрить исследование пиноподий в клиническую практику не во всех случаях было удачным, и ряд исследователей отмечают, что образование пиноподии не может быть точным маркером окна имплантации (10).
Другим маркером имплантации считается появление на эндометрии белков клеточной адгезии, в частности интегринов, которые способствуют прикреплению бластоцисты к поверхности эндометрия (11). Было показано, что экспрессия интегрина αvβ3 начиналась в естественном цикле на седьмой день после пика ЛГ, тогда как в циклах с применением овариальной стимуляции экспрессия этого фактора адгезии начинается с пятого дня после назначения ХГЧ, что может говорить о смещении окна имплантации при применении стимуляции яичников (12). Однако, несмотря на сообщения об успешном применении определения интегринов как маркеров имплантации у человека, не все исследователи сообщили о клинической применимости данных методов (13).
В последние годы большой интерес вызывает изучение экспрессии генов в различных тканях в норме и при патологии, и сравнение различий в функции этих генов (геномный подход или геномика). Так, в течение последних 10 лет были произведены ряд работ, которые показали, что в период имплантации, в середине лютеиновой фазы цикла, отмечается повышенная экспрессия ряда генов, чья функция связана с метаболизмом клеток, железистой секрецией, дифференцировкой клеток, межклеточной коммуникацией, врожденным иммунным ответом, ответом на стресс, механизмами заживления ран, механизмами адгезии и регуляцией протеолиза (14). На основании этих данных был предложено исследование, позволяющие оценить рецептивность эндометрия у конкретной пациентки с помощью изучения экспрессии генов в предполагаемый период имплантации. С этой целью необходимо получить образец эндометрия в естественном цикле, на седьмой день после пика ЛГ, или в цикле с применением гормон-заместительной терапии, на пятый день назначения прогестерона. Материал биопсии изучается на предмет экспрессии 238 генов выбранных путем тщательного анализа. Данный метод, использующий исследование на основе генетического чипа, получил название Endometrial Receptivity Array (ERA) - исследование рецептивности эндометрия, основанное на изучение экспрессии массива генов. Авторы утверждают, что их метод позволяет определить наличие рецептивности в конкретном образце эндометрия со специфичностью 0,88 и чувствительностью 0,99 (15). Дальнейшие исследования должны определить клиническую значимость данного метода.
Другим современным методом, который в перспективе должен определить рецептивность эндометрия, является исследования секрета эндометрия (секретомика). При исследовании применяются методики электрофореза в полиакриламидном геле в двух проекциях и высокочувствительная жидкостная хроматография. Эти методы позволяют тщательно определить состав секрета эндометрия в период имплантации. Особое внимание было уделено липидам, входящим в состав секрета эндометрия. Выяснилось, что концентрация 9 липидов была значительно повышена в секрете эндометрия в период окна имплантации: N-арахидоноил этаноламин, N-палмитоил этаноламин, N-олеоил этаноламин, 2- арахидоноил глицерол, N-стеароил этаноламин, N-линолеоил этаноламин, а также простагландины E2, F1 α и F2α. Дальнейшие исследования должны доказать клиническую значимость этих находок в клинической практике (16).
Приведенные данные свидетельствуют, что, несмотря на определенные успехи, к настоящему времени не существует общепринятого метода определения рецептивности эндометрия. В ежедневной клинической практике приходится пользоваться простыми методами, такими как определение толщины эндометрия, измеренного на день назначения овуляторной дозы ХГЧ в циклах овариальной стимуляции или на день начала назначения прогестерона в циклах гормон-заместительной терапии.
Толщина эндометрия – один из наиболее важных факторов, влияющих на частоту наступления беременности в ВРТ. Теоретически говоря, все циклы ВРТ могут быть разделены на 2 основных типа. К первому типу относятся циклы, в которых рост эндометрия обеспечивается эстрадиолом продуцируемым растущими фолликулами во время контролируемой овариальной стимуляции в программах ЭКО, ИКСИ, внутриматочной инсеминации, индукции овуляции. В этом случае применяются препараты антиэстрогенов (кломифенцитрат), ингибиторов ароматазы (летрозол), а также рекомбинантные и мочевые препараты ФСГ, обычно в сочетании с агонистами и антагонистами люлиберина.
Ко второму типу относятся циклы, в которых рост эндометрия происходит под воздействием экзогенного эстрадиола, что является одним из вариантов применения гормон-заместительной терапии. К этому типу относятся программа подготовки эндометрия в программе донации ооцитов, суррогатном материнстве и при циклах с размораживанием эмбрионов. В этом случае применяются препараты эстрадиола, которые могут быть доставлены пероральным, вагинальным и трансдермальным путем.
В обоих случаях, при стимуляции яичников и при гормон-заместительной терапии адекватный рост эндометрия порой является трудной проблемой.
Хорошо известно, что сама по себе овариальная стимуляция часто сопровождается тонким эндометрием. Классическим примером является применение кломифенцитрата (клостильбегита) при использовании которого частота овуляции составляет 50-70%, а частота наступления беременности только 5 - 10% (18). Основным фактором, определяющим такую диспропорцию, считается антиэстрогенное действие кломифенцитрата на рецепторы эстрогенов в эндометрии (19). В последние годы появился ряд исследований, которые показали, что при применении кломифенцитрата могут происходить изменения в рецептивности эндометрия. Так было показано, что при применении кломифенцитрата в клетках эпителия эндометрия в середине лютеиновой фазы цикла чаще наблюдаются рецепторы к прогестерону, что сопровождается значительно меньшей экспрессией интегрина β3, по сравнению с естественным циклом у тех же пациенток (20).
Группа российских исследователей показала, что уменьшение толщины эндометрия в циклах ЭКО с применением комбинации клостильбегита и препаратов человеческого менопаузального гонадотропина, по сравнению с циклами, где применялся длинный протокол, является основной причиной уменьшения частоты наступления беременности при использовании протоколов с клостильбегитом. Также авторы подчеркивают важность наличия многослойного (трехслойного) эндометрия, как прогностического маркера успеха в программах ЭКО (70).
Применение препаратов рекомбинантного или мочевого ФСГ сопровождается более выраженной толщиной эндометрия, однако и в этом случае часто наблюдается тонкий эндометрий. Эти факты трудно объяснимы, так как уровень эстрадиола в крови пациенток при овариальной стимуляции значительно превышает уровень в естественном цикле. Объяснение может быть связанно с тем, что сверхфизиологические уровни эстрадиола могут значительно менять характеристики рецептивности эндометрия, как было показано в исследованиях на грызунах (21). Также не следует забывать, что при овариальной стимуляции могут вырабатываться небольшие уровни прогестерона, могущие отрицательно влиять на развитие эндометрия (22,23).
Сам феномен отрицательного влияния тонкого эндометрия на сниженную частоту имплантации эмбриона также сложно объяснить. Было высказано предположение, что при толщине эндометрия < 7 мм может страдать функциональный слой, что приводит к тому, что бластоциста в процессе имплантации близко соприкасается со спиральными артериями и находится в области высокой концентрации кислорода. В настоящее время имеются работы, которые показывают, что культивирование эмбрионов происходит более успешно при пониженных концентрациях кислорода, что сопровождается большей выживаемостью бластоцист. Также в маточной трубе и брюшной полости наиболее низкие концентрации кислорода, найденные в организме человека, что частично может объяснить относительно высокую частоту возникновения у человека внематочной беременности (24).
Стоит также отметить ряд факторов определяющих параметры роста эндометрия, необходимых для успешной имплантации. Эти факторы были определены как при применении овариальной стимуляции, так и при применении гормон-заместительной терапии в программах ВРТ. Минимальный период, за который рецептивный эндометрий может вырасти составляет 5-7 дней и продолжительность назначения эстрадиола в 10-14 дней не является абсолютно необходимой. Если эндометрий не достигает нужных параметров за короткий период, назначение препаратов эстрадиола может быть продолжено. Продолжительность назначения эстрагенов может быть более трех недель. Однако у ряда пациенток длительное применение эстрадиола может вызвать прорывное кровотечение с отменой переноса эмбрионов в данном цикле. Назначение эстрадиола с нарастающей дозировкой не является необходимым. Во время фолликулярной фазы при овариальной стимуляции толщина эндометрия может меняться, в зависимости от уровня эстрадиола в крови, и эти изменения не являются фатальным (25). Назначение агонистов у пациенток с сохраненной функцией яичников при изолированном росте эндометрия без овариальной стимуляции не является обязательным (26).
Пероральное назначение эстрадиола хорошо переносится пациентками, однако следует отметить, что после перорального введения, этрадиол (Е2) активно метаболизируется в слизистой оболочке кишечника и в печени. При этом E2 легко преобразуется в эстрон (E1) и эстрон-сульфат (E1S), с уровнем в крови Е1 в три-шесть раз выше, чем E2. Эстрон является слабым эстрогеном с низким сродством для обоих α и β рецепторов эстрогенов. Таким образом, так называемый первый пассаж через печень, значительно снижает активность эстрадиола, что заставило искать альтернативные пути доставки препарата.
При наиболее часто применяемом пероральном пути применения эстрадиола наблюдается высокое соотношение Е1/Е2, и для обеспечения высокого уровня эстрадиола в сосудах снабжающих матку и непосредственно в эндометрии необходимо назначать высокие дозы перорального эстрадиола (25). В то же время трансдермальный путь обеспечивает устойчивый уровень эстрадиола и обходит первый пассаж через печень.
Было показано, что трансдермальный эстрадиол может вызывать адекватный рост эндометрия, несмотря на более низкую концентрацию эстрадиола в крови, по сравнению с пероральным путем. Более того было показано, что трандермальное применение эстрадиола благотворно влияет на рецептивность эндометрия (27). В настоящее время широко применяется препарат «Дивигель», компании «Орион», Финляндия, который может применятся как трансдермальный гель, содержащий эстрадиол.
Другой альтернативой пероральному пути доставки эстрадиола является вагинальное применение. Этот путь обеспечивает высокий уровень эстрадиола в ткани эндометрия, при низкий уровень соотношения Е1/Е2. Более того, при этом отмечается более высокое соотношение концентрации эстрадиола в крови к концентрации в эндометрии, чем наблюдается при овариальной стимуляции или при пероральном назначении (28). Также были сравнены показатели толщины эндометрия, маточного кровотока и сократительной активности матки у пациенток с применением вагинального или перорального эстрадиола. Было показано, что при вагинальном использовании статистически выше была толщина эндометрия, среднее PI маточной артерии, процент васкуляризации матки и число маточных сокращений в минуту (29).
В работе испанских исследователей было показано, что в программе донации ооцитов имеется строгая корреляция между уровнем эстрадиола в крови и толщиной эндометрия, в то время как зависимость между толщиной эндометрия и вероятностью беременности не была столь выраженной. Авторы отмечают, что беременности наблюдались и при толщине эндометрия менее 4 мм (17,30).
В исследовании, посвященном изучению толщины эндометрия у пациенток, проходящих овариальную стимуляцию в программе ЭКО, наблюдалась четкая корреляция между толщиной эндометрия и показателями маточного кровотока в цикле стимуляции, измеренными на день назначения ХГЧ и теме же показателями на день начала пика ЛГ в естественном цикле. Эти данные говорят о важности изначальных значений роста эндометрия, у пациенток планирующих вступать в программу ЭКО (31, 32).
Измерение толщины эндометрия в циклах ЭКО может носить субъективный характер и не отражать собственно объема ткани эндометрия в матке. Было показано, что измерение объема эндометрия с помощью 3-D технологии может более точно определять вероятность беременности, чем простое измерение толщины эндометрия. В работе испанских исследователей толщина эндометрия в циклах с наступившей беременностью не отличалась от циклов, где беременность не наступила, тогда, как измерение объема эндометрия выявила статистически значимую разницу в этих группах пациенток (33).
Также важнейшим показателем ряд исследователей считает эхографические особенности эндометрия. В работе китайских исследователей одновременно с толщиной эндометрия изучалось наличие трехслойного паттерна эндометрия. Было показано, что даже в случае толщины эндометрия менее 7 мм и наличия трехслойной структуры отмечалась частота наступления беременности 24,4% и низкая частота выкидышей в первом триместре, тогда как в случае отсутствия трехслойности, беременностей не наблюдалось (34). В другом исследовании было показано, что при толщине эндометрия менее 9 мм и продолжительности стимуляции более 11 дней наблюдается статистически более низкая частота наступления беременности, чем при той же толщине эндометрия и меньшей продолжительности стимуляции (35).
В настоящее время не существует общепринятого определения «тонкого эндометрия». В различных исследованиях, авторы сообщают разную толщину эндометрия, которая считается недостаточной для успешной имплантации. Так американские исследователи Dix E и Check JH. считают, что тонкий эндометрий наблюдается у пациенток с толщиной эндометрия менее 6 мм и у таких пациенток частота наступления беременности и родов составила 8,5% и 5,7%, соответственно. Переносы эмбрионов и измерение толщины эндометрия были проведены у 35 пациенток, как в протоколах овариальной стимуляции, так и в криопротоколах (36). Испанские исследователи на большой группе пациенток, включенных в программу донации ооцитов, показали, что толщина эндометрия реципиентов не влияет на частоту наступления беременности и 6 мм является достаточной для благоприятного прогноза. Авторы отмечают, что атрофический эндометрий 5 мм и менее встречался крайне редко изученной группе пациенток (37). Швейцарские исследователи изучили характеристики роста эндометрия у 981 пациенток с бесплодием, у которых было проведено 1600 циклов овариальной стимуляции в циклах ВРТ. Авторы показали, что у пациенток с тонким эндометрием, который был определен как менее 6,3 мм, отмечаются значительно более низкие частоты наступления беременности и родов (38). Исследователи из Гонконга изучали частоту наступления беременности у 136 пациенток, проходивших первую попытку лечения бесплодия методом ЭКО. В циклах с овариальной стимуляцией, у пациенток с толщиной эндометрия 7 мм и менее частота наступления беременности составила 3,8%, тогда как у пациенток с толщиной эндометрия 8 мм и более, эта частота составила 28%, различия статистически значимые. При переносе размороженных эмбрионов, осуществленных в естественном цикле, также отмечалась более низкая частота наступления беременности у пациенток с толщиной эндометрия 7 мм и менее – 5%, по сравнению с пациентками у которых толщина эндометрия была 8 мм и более – 30,9%, различия статистически значимые. Авторы определяли «тонкий эндометрий» при толщине 7 мм и менее (31). В работе испанских исследователей, изучалось влияние различных факторов на частоту наступления беременности в программах донации ооцитов. Авторы отмечают, что назначение эстрадиола реципиентам от двух до семи недель не влияло на частоты имплантации и беременности. В то же время толщина эндометрия менее 7 мм признается авторами удовлетворительной в плане частоты наступления беременности, однако толщина эндометрия 5 мм и менее ассоциирована с атрофическими изменениями в эндометрии (39). Израильские специалисты исследовали тонкий эндометрий, не отвечающий на стимуляцию. У 13 из 1405 пациенток наблюдался эндометрий менее 7 мм, несмотря на хороший ответ яичников в программе ЭКО и высокий уровень эстрадиола в крови. Средний возраст пациенток составил 35,9±5,7, у десяти из них в анамнезе имелись выскабливания полости матки. Во время гистероскопии у 4 пациенток были обнаружены внутриматочные синехии, которые были разделены. В общей сложности у этих пациенток было предпринято 99 попыток стимуляции в программе ЭКО, причем в 22 циклах удалось получить эндометрий 7 мм и более. В 49 циклах были произведены переносы эмбрионов, в результате чего наступило 11 беременностей, 8 из которых закончились выкидышами, 2 были прерваны из-за наличия уродств плода, и одна беременность закончилась успешными родами (40). Другая группа специалистов из Израиля изучала влияние толщины эндометрия у пациенток, проходящих процедуру ЭКО. Были изучены 2334 цикла с овариальной стимуляцией и выяснилось, что толщина эндометрия 7 мм и менее, статистически достоверно была ассоциирована с уменьшенной частотой возникновения беременности по сравнению с пациентками с большей толщиной эндометрия. Однако, при исследовании этого феномена у пациенток различного возраста выяснилось, что у пациенток 35 лет и моложе, нет выраженной зависимости толщины эндометрия и вероятности наступления беременности, в то же самое время у пациенток старше 35 лет такая зависимость резко выражена, и при толщине эндометрия 7 мм и менее частота наступления беременности составляет 10,8%, при толщине эндометрия от 7,1 мм до 14 мм 18%, и при толщине эндометрия от 14,1 мм и более 36,4%. Авторы делают вывод о наличии у человека механизма старения эндометрия и возможном отрицательном влиянии этого процесса на вероятность беременности в программе ЭКО (41). Американские специалисты изучали влияние толщины эндометрия на показатели эффективности программы ЭКО. При исследовании 516 циклов ЭКО с переносом эмбрионов в полость матки наблюдались статистически значимые различия в частотах имплантации, клинической и развивающейся беременности у пациенток с толщиной эндометрия менее и более 9 мм, 14,3% и 24,4%,16.0% и 48,6%,11.7% и 42.2%, соответственно. Также меньшая частота наступления беременности наблюдалась у пациенток с гиперэхогенным (солидным) эндометрием (42).
Другая группа американских исследователей показала, что у пациенток проходящих лечение методом ЭКО с толщиной эндометрия менее 9 мм, частота наступления беременности составляет 53% при переносе эмбрионов на пятый день культивирования, тогда как при толщине эндометрия 16 мм и более частота наступления беременности составила 77%. Различия статистически достоверные, исследование проведено на 1294 пациентках, страдающих бесплодием. В тоже время авторы отмечают, что у 6 пациенток с толщиной эндометрия 6 мм удалось получить 3 беременности, закончившиеся родами (43).

Итальянские исследователи изучали особенности роста эндометрия у пациенток проходящих лечение методом ЭКО и ИКСИ. Тонкий эндометрий, менее 10 мм, чаще встречался у пациенток проходящих лечение методом ЭКО, в 27,5% случаев, и при применении ИКСИ, в 16,7% случаев, различия статистически достоверные. В то же время было установлено, что у пациенток проходивших лечение методом ЭКО, при эндометрии толщиной 10 мм и более, частота наступления беременности составила 41% и была выше, чем у пациенток с толщиной эндометрия менее 10 мм, где она составила 17%, различия статистически достоверные. В то же время, при анализе влияния толщины эндометрия на частоту наступления беременности у пациенток группы, где применялась методика ИКСИ, не было найдено зависимости частоты наступления беременности от толщины эндометрия. Авторы делают вывод, что тонкий эндометрий, чаще встречается у бесплодных пар, где выявлена женская причина бесплодия, которая часто связанна с патологией матки различной этиологии, тогда как у супружеских пар с мужским фактором бесплодия такая патология встречается значительно реже и в этой группе пациентов тонкий эндометрий не играет существенной роли. (44).
Американские исследователи также изучали влияние толщины эндометрия на частоту наступления беременности у 897 пациенток с переносом эмбрионов в программах ЭКО. Было выяснено, что высокая частота наступления беременности наблюдается у пациенток с толщиной эндометрия 9 мм и более, и составила 39%, тогда как у пациенток с толщиной эндометрия менее 9 мм, частота наступления беременности составила 16%, значения статистически достоверные (35).

Частота встречаемости тонкого эндометрия зависит от пороговой величины, которая определяет это понятие. Так Noyes N. с соавт. сообщили, что у пациенток в программе ЭКО эндометрий 3 мм и менее встречается в 3,1% случаев, тогда как эндометрий менее 7 мм встречался в 12,8% (42). Shufaro Y. с соавт. сообщили, что повторяющийся тонкий эндометрий менее 7 мм толщиной встречается у 0,9% пациенток проходящих лечение методом ЭКО (40). Amir c соавт. выявили, что из 2334 циклов ЭКО, эндометрий толщиной менее 7 мм встречался у 6,9% пациенток (41).
Крайне интересным является тот факт, что в литературе имеется противоречивое мнение на счет значения толщины эндометрия в плане прогноза частоты наступления у пациенток, включенных в программу ВРТ. Так Rinaldi с соавт., Remohi с соавт., de Geyter с соавт.,, Garcia-Velasco с соавт.,, Soares с соавт., сообщили об отсутствии влияния толщины эндометрия на вероятность беременности в программах ВРТ (44, 30, 38,45, 37). В то же время ряд авторов считают, что эндометрий является важным фактором определяющим вероятность беременности, однако единого мнения о пороговой толщине эндометрия в литературе нет. Так Coulam с соавт. и Noyes с соавт. считают, что эндометрий толщиной 6мм и менее может быть связан с низкой частотой наступления беременности (47,42). Al Shawaf с соавт. и Amir с соавт. сделали вывод из своих исследований, что эндометрий толщиной 7 мм и менее может значительно ухудшать прогноз процедуры ЭКО (46,41) . В то же время Sher с соавт. и Zhang с соавт. считают, что эндометрий 8 мм и менее может быть охарактеризован как тонкий (48,35). В то же время Check с соавт. считает, что эндометрий толщиной менее 10 мм может значительно ухудшать результаты ВРТ(49).
Эти противоречивые данные нуждаются в комментарии. Дело в том, что большинство работ в которых авторы не нашли связи между толщиной эндометрия и частотой наступления беременности выполнены на пациентках проходящих лечение бесплодия методом донации ооцитов и рост эндометрия был обеспечен экзогенным эстрадиолом. В тоже время большинство работ, в которых была найдена между толщиной эндометрия и результатами ВРТ, была выполнена на пациентках проходящих овариальную стимуляцию в программах ЭКО/ИКСИ, и рост эндометрия был обеспечен эндогенным эстрадиолом, вырабатываемым яичниками под воздействием стимуляции. Сами характеристики роста эндометрия при овариальной стимуляции могут сильно отличаться от аналогичных, как в естественном цикле, так и в цикле гормон-заместительной терапии. Сам рост может быть слабо выраженным, что имеет место в случае недостаточного уровня эстрадиола при плохом ответе яичников на овариальную стимуляцию, также может иметь место и отрицательное влияние сверхвысоких доз эстрадиола на эндометрий, что имеет место в случае нормального, а также чрезмерного ответа яичников на стимуляцию. Также описан механизм преждевременных секреторных изменений в эндометрии под воздействием прогестерона, выделяемых яичниками некоторых пациенток при овариальной стимуляции (50, 51,52). Косвенным подтверждением важности не самой толщины эндометрия, а отсутствия преждевременных секреторных изменений, являются работы в которых была обнаружена высокая частота наступления беременности при трехслойном эндометрии, характерном для фолликулярной фазы цикла (34).
Также важен вопрос о пороговом значении толщины эндометрия. Так в современных работах считается, что в программе донации ооцитов толщина эндометрия 7мм, и даже 6 мм может быть признана удовлетворительной, и сопровождается высокой частотой наступления беременности (37). Эти же данные с определенной осторожностью могут быть применены и для программ подготовки эндометрия при суррогатном материнстве и при переносе эмбрионов в криопротоколах. Что касается программ ЭКО, то обычно считается, что минимально желаемая толщина эндометрия должна составлять 7-8 мм, и эндометрий более тонкий считается неблагоприятным признаком в плане наступления развивающейся беременности. Ряд специалистов считают, что наличие тонкого эндометрия может служить показанием для заморозки всех эмбрионов с целью переноса в следующих специально подготовленных циклах, где толщина эндометрия может быть большей. И это при том факте, что в литературе есть сообщения, об успешных беременностях в программах ЭКО при крайне низкой толщине эндометрия менее 4 мм (53, 54), а также Сhen с соавт. сообщил о частоте родов 50% у пациенток с толщиной эндометрия 6 мм (34). Также достаточно большое число специалистов считает, что есть определенная связь между толщиной эндометрия и вероятностью беременности в цикле ЭКО, хотя прямая зависимость и отсутствует, так как частота наступления беременности зависит от множества причин (55).
Однако все авторы подчеркивают, что крайне тонкий атрофический эндометрий 5 мм толщиной может являться явной причиной отсутствия имплантации в программах ВРТ. Причиной атрофического эндометрия чаще всего является наличие в полости матки синехий, крайней выраженностью чего может быть синдром Ашермана (56). Сами спайки чаще всего образуются в результате выскабливаний полости матки, чаще неоднократных, а также произведенных при многоплодной беременности (40). Также присутствие атрофического эндометрия может быть связано с перенесенной лучевой и химиотерапией. Наличие не отвечающего на стимуляцию эндометрия может быть связанно с наличием аномалий развития матки. Также в программах донации ооцитов у пациенток с синдромом Шершевского – Тернера встречается наличие резистентного эндометрия, не отвечающего на высокие дозы гормон-заместительной терапии (57). В нашей практике встретился случай наличия атрофического эндометрия после проведенной операции трахелэктомии у пациентки перенесшей рак шейки матки. В литературе имеются упоминания, что причиной тонкого эндометрия может быть перенесенный эндометрит (58), однако современные исследования показали что хронический эндометрит не может быть признан значимой причиной отсутствия имплантации в программе ЭКО (59,60).
За последние годы были предложены ряд подходов направленных на увеличение толщины эндометрия в случае наличия тонкого эндометрия. Первым из таких подходов следует считать назначение препаратов эстрадиола. Так Сhen с соавт. предложил использовать экстенсивное назначение препаратов эстрадиола и получил увеличение толщины эндометрия с 6,7 до 8,6 мм (61). В то же время турецкие исследователи изучали назначения эстрадиола у пациенток с тонким эндометрием в программе ИКСИ. При обнаружении эндометрия 8 мм и менее, пациентки были разделены на 2 группы. 57 пациенток получали 4 мг эстрадиола перорально, 60 пациенток вошли в контрольную группу. Не было найдено статистически значимых различий в частоте наступления беременности, частоте имплантации и в частоте выкидышей (62).
Группа российских авторов изучала влияние назначения экзогенного эстрадиола у пациенток проходящих лечение методом ЭКО в длинном протоколе. Выяснилось, что назначения препаратов эстрадиол-валиориората в дозе 4 мг, начиная с 7 дня менструального цикла, что значительно увеличивает как толщину эндометрия, так и частоту наступления беременности (63). Французские исследователи предложили использовать альтернативный путь применения препаратов эстрадиола. Было обнаружено, что при вагинальном применении этих препаратов наблюдается большая толщина эндометрия, чем при пероральном назначении (64). В тоже самое время, назначение аспирина 100мг в сутки не улучшало показателей роста эндометрия, как было показано при использовании этого препарата в криопротоколах (65). Американские исследователи изучали подходы к увеличению частоту наступления беременности у 105 пациенток в возрасте до 40 лет, у которых было 2 неудачных попытки ЭКО в анамнезе, и наблюдался неадекватный ответ эндометрия на стимуляцию. Во время следующей попытки овариальной стимуляции пациенткам был назначен силденафил (виагра) в дозе 25 мг четыре раза в день вагинально в виде свечей. У 73 пациенток толщина с эндометрия составила 9 мм и более и в этой группе наблюдалась высокая частота наступления развивающейся беременности и имплантации 45% и 29%, соответственно. У 32 пациенток эндометрий был менее 9 мм, и в этой группе наступила одна беременность, которая закончилась выкидышем, частоты развивающейся беременности и имплантации 0% и 2%, соответственно (58). Японские исследователи сравнивали влияние назначения силденафила, L-аргинина и витамина Е на показатели роста у пациенток с тонким эндометрием. Выяснилось, что вагинальный силденафил является лучшим препаратом для увеличения толщины эндометрия у этой группы пациенток (66). Недавно группа американских исследователей сообщила об успешном применении препарата филграстим, содержащего рекомбинантный гранулоцит колониестимулирующий фактор роста с целью увеличения частоты наступления беременности у пациенток с тонким эндометрием. Было показано, что у таких пациенток наблюдалось увеличение толщины эндометрия при однократном внутриматочном введение филграстима. У всех четырех пациенток наступила беременность, три в полости матки и одна эктопическая (67). В последующем те же авторы сообщили, что из 21 пациентки, у которых наблюдался тонкий эндометрий во время стимуляции в программе ЭКО, несмотря на назначение препаратов эстрадиола и силденафила, при однократном или двукратном назначение промывания полости матки филграстимом наблюдалось увеличение толщины эндометрия и у 4 пациенток наступила беременность, что составило 19.1%. Авторы не уточняют, были ли включены в эту группу пациентки из первого сообщения (68).
Заключение.
Тонкий эндометрий является сложным и до конца не изученным феноменом в современной репродуктологии. Нет единого мнения, какая толщина эндометрия является недостаточной для успешной имплантации. Более того, вероятно для циклов с овариальной стимуляцией и для циклах с подготовкой эндометрия в программах донации ооцитов, суррогатном материнстве и криопротоколах, эта толщина может быть различной. Так многочисленные работы показали, что толщина эндометрия 6-7 мм является достаточной для получения удовлетворительной частоты наступления беременности в программе донации ооцитов. В циклах с применением контролируемой овариальной стимуляции в программе ЭКО, наличие эндометрия менее 7 мм, является признаком недостаточной или неадекватной реакции эндометрия. Также признаки гиперэхогенного эндометрия могут косвенно свидетельствовать о преждевременном подъеме прогестерона в конце фолликулярной фазы цикла, что отрицательно может сказаться на частоте имплантации ЭКО.
В тоже время атрофический эндометрий толщиной 5 мм и менее, может служить симптомом наличия в матке синехий и синдрома Ашермана и вне зависимости от типа применяемой программы ВРТ, ассоциирован с плохим прогнозом. Предложенные подходы для увеличения толщины эндометрия в программах ЭКО включают интенсивное назначение препаратов эстрогенов, в том числе и с применением альтернативных путей доставки (трансдермальный и вагинальный), назначения аспирина, вагинального силденафила, а также назначение промывания полости матки филграстимом. Для подтверждения эффективности данных способов воздействия на тонкий эндометрий необходимы дальнейшие рандомизированные контролируемые исследования.
Список литературы.
1. Edwards RG. Human implantation: the last barrier in assisted reproduction technologies? Reprod Biomed Online. 2006, т.13, стр. 887-904
2. Macklon NS, Geraedts JP, Fauser BC.Conception to ongoing pregnancy: the 'black box' of early pregnancy loss. Hum Reprod Update. 2002 т.8, стр. 333-343
3. Boomsma CM, Kavelaars A, Eijkemans MJ, Lentjes EG, Fauser BC, Heijnen CJ, Macklon NS.Endometrial secretion analysis identifies a cytokine profile predictive of pregnancy in IVF. Hum Reprod. 2009, т.24, стр. 1427-1435
4. Dunson DB, Colombo B, Baird DD.Changes with age in the level and duration of fertility in the menstrual cycle. Hum Reprod. 2002 т. 17, стр. 1399-1403
5. Noyes R., Hertig A., Rock J. Dating of endometrial biopsy. Fertil.Steril., 1: 3-25, 1950 ,Noyes RW, Hertig AT, Rock J. Dating the endometrial biopsy. Am J Obstet Gynecol. 1975 т.122, стр. 262-263
6. Lessey B. Endometrial integrins and the establishment of uterine receptivity, Human Reproduction 1998, т. 13, Прил 3, стр. 247-58
7. Nikas G.Cell-surface morphological events relevant to human implantation. Hum Reprod. 1999 т. 14 Прил 2, стр. 7-44
8. Bentin-Ley U, Sjцgren A, Nilsson L, Hamberger L, Larsen JF, Horn T. Presence of uterine pinopodes at the embryo-endometrial interface during human implantation in vitro. Hum Reprod. 1999 т.14, стр. 515-520
9. Nikas G. Pinopodes as markers of endometrial receptivity in clinical practice. Hum Reprod. 1999 т. 14 Прил 2, стр. 99-106
10. Quinn С., Ryan E., Claessens E.A., Greenblatt E., Hawrylyshyn P., Cruickshank B. et al. The presence of pinopodes in the human endometrium does not delineate the implantation window. Fertil Steril, 2007, т. 87 стр. 1015–1021
11. Lessey B., Ilesanmi A., Sun J., Lessey M., Harris J., Chwalisz K. Luminal and glandular endometrial epithelium express integrins differentially throughout the menstrual cycle: implications for implantation, contraception, and infertility Am J Reprod Immunol, 1996, т. 35, стр. 195–204
12. Thomas K, Thomson AJ, Sephton V, Cowan C, Wood S, Vince G, Kingsland CR, Lewis-Jones DI. The effect of gonadotrophic stimulation on integrin expression in the endometrium. Hum Reprod. 2002 т.17, стр. 63-68
13. Lessey BA. Assessment of endometrial receptivity. Fertil Steril. 2011 Sep;96(3):522-9
14. Ruiz-Alonso M, Blesa D, Simуn C. The genomics of the human endometrium. Biochim Biophys Acta. 2012 т. 1822, стр. 1931-1942
15. Garrido-Gуmez T, Ruiz-Alonso M, Blesa D, Diaz-Gimeno P, Vilella F, Simуn C.Profiling the gene signature of endometrial receptivity: clinical results. Fertil Steril. 2013 т.99, стр.1078-1085
16. Berlanga O, Bradshaw HB, Vilella-Mitjana F, Garrido-Gуmez T, Simуn C.How endometrial secretomics can help in predicting implantation. Placenta 2011 т.32 Прил 3, стр.S271-275
17. Amui J, Check JH, Cohen R.Successful twin pregnancy in a donor oocyte recipient despite a maximum endometrial thickness in the late proliferative phase of 4 mm. Clin Exp Obstet Gynecol. 2011 т.38, стр. 328-329
18. Diamond MP, Kruger M, Santoro N, et al. Endometrial shedding effect on conception and live birth in women with polycystic ovary syndrome. Obstet Gynecol. 2012 т. 119, стр. 902-908
19. Gonen Y, Casper RF. Sonographic determination of a possible adverse effect of clomiphene citrate on endometrial growth. Hum Reprod. 1990 т.5, стр. 670-674
20. Palomino WA, Fuentes A, Gonzбlez RR, Gabler F, Boric MA, Vega M, Devoto L. Differential expression of endometrial integrins and progesterone receptor during the window of implantation in normo-ovulatory women treated with clomiphene citrate. Fertil Steril. 2005 т.83, стр. 587-593
21. Ma WG, Song H, Das SK, Paria BC, Dey SK. Estrogen is a critical determinant that specifies the duration of the window of uterine receptivity for implantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 т. 100, стр. 2963-2968
22. Ezra Y, Simon A, Sherman Y, Benshushan A, Younis JS, Laufer N. The effect of progesterone administration in the follicular phase of an artificial cycle on endometrial morphology: a model of premature luteinization. Fertil Steril. 1994 т.62, стр. 108-112
23. Fleming R, Jenkins J. The source and implications of progesterone rise during the follicular phase of assisted reproduction cycles. Reprod Biomed Online. 2010 т. 21, стр. 446-449
24. Casper RF It's time to pay attention to the endometrium. Fertil Steril. 2011 т.96, стр. 519-521
25. Paulson RJ. Hormonal induction of endometrial receptivity. Fertil Steril. 2011 т.96, стр.530-535
26. Ghobara T, Vandekerckhove P. Cycle regimens for frozen-thawed embryo transfer. Cochrane Database Syst Rev. 2008 Jan 23;(1):CD003414
27. Krasnow JS, Lessey BA, Naus G, Hall LL, Guzick DS, Berga SL.Comparison of transdermal versus oral estradiol on endometrial receptivity. Fertil Steril. 1996 т. 65, стр. 332-336
28. Tourgeman DE, Boostanfar R, Chang L, Lu J, Stanczyk FZ, Paulson RJ.Is there evidence for preferential delivery of ovarian estradiol to the endometrium? Fertil Steril. 2001 т.75, стр.1156-1158
29. Fanchin R, Righini C, Schцnauer LM, Olivennes F, Cunha Filho JS, Frydman R.Vaginal versus oral E(2) administration: effects on endometrial thickness, uterine perfusion, and contractility. Fertil Steril. 2001 т.76, стр.994-998
30. Remohн J, Ardiles G, Garcнa-Velasco JA, Gaitбn P, Simуn C, Pellicer A.Endometrial thickness and serum oestradiol concentrations as predictors of outcome in oocyte donation. Hum Reprod. 1997 т.12, стр. 2271-2276
31. Basir GS, O WS, So WW, Ng EH, Ho PC.Evaluation of cycle-to-cycle variation of endometrial responsiveness using transvaginal sonography in women undergoing assisted reproduction. Ultrasound Obstet Gynecol. 2002 т.19, стр.484-9
32. Basir GS, Lam TP, O Ws, Chau MT, Ng EH, Ho PC.Cycle-to-cycle variation in utero-ovarian hemodynamic indices in ovarian stimulation and natural cycles of the same women and its effect on the outcome of assisted reproduction treatment. Fertil Steril. 2002 т. 78, стр. 1055-1060
33. Mercй LT, Barco MJ, Bau S, Troyano J.Are endometrial parameters by three-dimensional ultrasound and power Doppler angiography related to in vitro fertilization/embryo transfer outcome? Fertil Steril. 2008 т. 89, стр. 111-117
34. Chen SL, Wu FR, Luo C, Chen X, Shi XY, Zheng HY, Ni YP Combined analysis of endometrial thickness and pattern in predicting outcome of in vitro fertilization and embryo transfer: a retrospective cohort study. Reprod Biol Endocrinol. 2010 т. 24 стр. 30
35. Zhang X, Chen CH, Confino E, Barnes R, Milad M, Kazer RR.Increased endometrial thickness is associated with improved treatment outcome for selected patients undergoing in vitro fertilization-embryo transfer. Fertil Steril. 2005 т. 83, стр. 336-340.
36. Dix E, Check JH. Successful pregnancies following embryo transfer despite very thin late proliferative endometrium. Clin Exp Obstet Gynecol. 2010 т. 37, стр. 15-16
37. Soares SR, Velasco JA, Fernandez M, Bosch E, Remohн J, Pellicer A, Simуn C.Clinical factors affecting endometrial receptiveness in oocyte donation cycles. Fertil Steril. 2008 т.89, стр. 491-501
38. De Geyter C, Schmitter M, De Geyter M, Nieschlag E, Holzgreve W, Schneider HP. Prospective evaluation of the ultrasound appearance of the endometrium in a cohort of 1,186 infertile women. Fertil Steril. 2000 т.73, стр. 106-113
39. Vernaevea V.Soares R., Budak E. et al. Clinical factors associated with the outcome of oocyte donationGynйcologie Obstйtrique & Fertilitй 2007 т.35 стр. 1015–1023
40. Shufaro Y, Simon A, Laufer N, Fatum M Thin unresponsive endometrium—a possible complication of surgical curettage compromising ART outcome J Assist Reprod Genet 2008 т. 25 стр. 421–425
41. Amir W, Micha B, Ariel H, Liat LG, Jehoshua D, Adrian S. Predicting factors for endometrial thickness during treatment with assisted reproductive technology. Fertil Steril. 2007 т.87, стр. 799-804
42. Noyes N, Liu HC, Sultan K, Schattman G, Rosenwaks Z.Endometrial thickness appears to be a significant factor in embryo implantation in in-vitro fertilization. Hum Reprod. 1995 т. 10, стр. 919-922
43. Richter KS, Bugge KR, Bromer JG, Levy MJ. Relationship between endometrial thickness and embryo implantation, based on 1,294 cycles of in vitro fertilization with transfer of two blastocyst-stage embryos. Fertil Steril. 2007 т.87, стр. 53-59
44. Rinaldi L, Lisi F, Floccari A, Lisi R, Pepe G, Fishel S. Endometrial thickness as a predictor of pregnancy after in-vitro fertilization but not after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 1996 т. 11 стр. 1538-1541
45. Garcia-Velasco JA, Isaza V, Caligara C, Pellicer A, Remohн J, Simуn C.Factors that determine discordant outcome from shared oocytes. Fertil Steril. 2003 т. 80, стр. 54-60.
46. Al-Shawaf T, Yang D, al-Magid Y, Seaton A, Iketubosin F, Craft I.Ultrasonic monitoring during replacement of frozen/thawed embryos in natural and hormone replacement cycles. Hum Reprod. 1993 т. 8, стр. 2068-2074.
47. Coulam CB, Bustillo M, Soenksen DM, Britten S.Ultrasonographic predictors of implantation after assisted reproduction. Fertil Steril. 1994 т. 62, стр. 1004-1010.
48. Sher G, Herbert C, Maassarani G, Jacobs MH.Assessment of the late proliferative phase endometrium by ultrasonography in patients undergoing in-vitro fertilization and embryo transfer (IVF/ET). Hum Reprod. 1991 т. 6, стр. 232-237.
49. Check JH, Nowroozi K, Choe J, Lurie D, Dietterich C.The effect of endometrial thickness and echo pattern on in vitro fertilization outcome in donor oocyte-embryo transfer cycle. Fertil Steril. 1993 т. 59, стр. 72-75.
50. Devroey P, Bourgain C, Macklon NS, Fauser BC. Reproductive biology and IVF: ovarian stimulation and endometrial receptivity. Trends Endocrinol Metab. 2004 т. 15, стр. 84-90.
51. Fleming R, Jenkins J.The source and implications of progesterone rise during the follicular phase of assisted reproduction cycles. Reprod Biomed Online. 2010 т. 21, стр. 446-449
52. Bosch E, Labarta E, Crespo J, Simуn C, Remohн J, Jenkins J, Pellicer A.Circulating progesterone levels and ongoing pregnancy rates in controlled ovarian stimulation cycles for in vitro fertilization: analysis of over 4000 cycles. Hum Reprod. 2010 т. 25, стр. 2092-2100
53. Sundstrom P. Establishment of a successful pregnancy following in-vitro fertilization with an endometrial thickness of no more than 4 mm. Hum Reprod 1998 т. 13, стр. 1550–1552.
54. Check JH, Cohen R.Live fetus following embryo transfer in a woman with diminished egg reserve whose maximal endometrial thickness was less than 4 mm. Clin Exp Obstet Gynecol. 2011 т. 38, стр. 330-332.
55. Kovacs P, Matyas S, Boda K, Kaali SG.The effect of endometrial thickness on IVF/ICSI outcome. Hum Reprod. 2003 т. 18, стр. 2337-2341.
56. Yu D, Wong YM, Cheong Y, Xia E, Li TC Asherman syndrome--one century later. Fertil Steril. 2008 т. 89, стр. 759-779.
57. Press F, Shapiro HM, Cowell CA, Oliver GD Outcome of ovum donation in Turner's syndrome patients. Fertil Steril. 1995 Nov;64(5):995-8.
58. Sher G, Fisch JD. Effect of vaginal sildenafil on the outcome of in vitro fertilization (IVF) after multiple IVF failures attributed to poor endometrial development. Fertil Steril. 2002 Nov;78(5):1073-6.
59. Kasius JC, Fatemi HM, Bourgain C, Sie-Go DM, Eijkemans RJ, Fauser BC, Devroey P, Broekmans FJ.The impact of chronic endometritis on reproductive outcome. Fertil Steril. 2011 Dec;96(6):1451-6
60. Kasius JC, Broekmans FJ, Sie-Go DM, Bourgain C, Eijkemans MJ, Fauser BC, Devroey P, Fatemi HM.The reliability of the histological diagnosis of endometritis in asymptomatic IVF cases: a multicenter observer study. Hum Reprod. 2012 Jan;27(1):153-8.
61. Chen MJ, Yang JH, Peng FH, Chen SU, Ho HN, Yang YS.Extended estrogen administration for women with thin endometrium in frozen-thawed in-vitro fertilization programs. J Assist Reprod Genet. 2006 Jul-Aug;23(7-8):337-42.
62. Demir B, Dilbaz S, Cinar O, Ozdegirmenci O, Dede S, Dundar B, Goktolga U.Estradiol supplementation in intracytoplasmic sperm injection cycles with thin endometrium. Gynecol Endocrinol. 2013 Jan;29(1):42-5
63. Kornilov N. et al. Effect of exogenous estradiol on the results of IVF Human Reproduction, O-052, ESHRE-1999
64. Fanchin R, Righini C, Schцnauer LM, Olivennes F, Cunha Filho JS, Frydman R.Vaginal versus oral E(2) administration: effects on endometrial thickness, uterine perfusion, and contractility. Fertil Steril. 2001 Nov;76(5):994-8.
65. Glujovsky D, Pesce R, Fiszbajn G, Sueldo C, Hart RJ, Ciapponi A.Endometrial preparation for women undergoing embryo transfer with frozen embryos or embryos derived from donor oocytes. Cochrane Database Syst Rev. 2010 Jan 20;(1):CD006359.
66. Takasaki A, Tamura H, Miwa I, Taketani T, Shimamura K, Sugino N Endometrial growth and uterine blood flow: a pilot study for improving endometrial thickness in the patients with a thin endometrium. Fertil Steril. 2010 Apr;93(6):1851-8
67. Gleicher N, Vidali A, Barad DH.Successful treatment of unresponsive thin endometrium. Fertil Steril. 2011 May;95(6):2123.e13-7.
68. Gleicher N, Kim A, Michaeli T, Lee HJ, Shohat-Tal A, Lazzaroni E, Barad DH.A pilot cohort study of granulocyte colony-stimulating factor in the treatment of unresponsive thin endometrium resistant to standard therapies. Hum Reprod. 2013 Jan;28(1):172-7.
69. В.С. Корсак, Б.А. Каменецкий, А.В. Михайлов Значимость толщины и ультразвуковой структуры эндометрия в программе ЭКО. Проблемы репродукции 2001 год > №3
70. Применение ультразвукового сканирования эндометрия в программах вспомогательной репродукции Журнал "Проблемы репродукции" > Номера журнала за 2001 год > №2 Б.А. Каменецкий

Большинство врачей считают началом беременности первый день последнего менструального периода. Данный период называется «менструальный возраст», он начинается приблизительно за две недели до оплодотворения. Ниже приведена основная информация об оплодотворении:
Овуляция
Каждый месяц в одном из женских яичников начинает развиваться определенное количество недозрелых яйцеклеток в маленьком пузыре, заполненном жидкостью. Один из пузырьков завершает созревание. Этот «доминантный фолликул» подавляет рост других фолликулов, которые прекращают рост и дегенерируют. Зрелый фолликул разрывается и выпускает яйцеклетки из яичника (овуляция). Овуляция происходит, как правило, за две недели до начала ближайшего менструального периода у женщины.
Развитие желтого тела
После овуляции разорванный фолликул развивается в образование, которое называется желтое тело, выделяющее два вида гормонов – прогестерон и эстроген. Прогестерон способствует подготовке эндометрия (слизистой оболочки матки) к внедрению эмбриона, утолщая его.
Высвобождение яйцеклетки
Яйцеклетка высвобождается и попадает в фаллопиеву трубу, где находится до тех пор, пока хотя бы один сперматозоид попадает в нее во время оплодотворения (яйцеклетка и сперматозоид, см. ниже). Яйцеклетка может оплодотвориться в течение 24 часов после овуляции. В среднем овуляция и оплодотворение происходят через две недели после последнего менструального периода.
Менструальный цикл
Если сперма не оплодотворяет яйцеклетку, она и желтое тело дегенерируют; исчезнет и повышенный уровень гормонов. Затем происходит отторжение функционального слоя эндометрия, что приводит к менструальному кровотечению. Цикл повторяется.
Оплодотворение
Если сперматозоид попадает в зрелую яйцеклетку, он оплодотворяет ее. Когда сперматозоид попадает в яйцеклетку, происходит изменение в протеиновой оболочке яйцеклетки, которая более не впускает сперматозоиды. В этот момент закладывается генетическая информация о ребенке, в том числе и его пол. Мать дает только Х-хромосомы (мать=ХХ); если сперматозоид-У оплодотворяет яйцеклетку, ребенок будет мужского пола (ХУ); если же оплодотворяет сперматозоид-Х, родится девочка (ХХ).

Оплодотворение - это не просто суммирование ядерного материала яйцеклетки и сперматозоида - это сложный комплекс биологических процессов. Ооцит окружен гранулезными клетками, которые называются corona radiata. Между corona radiata и ооцитом образуется zona pellucida, в которой содержатся специфические рецепторы для спермиев, предотвращающие полиспермию и обеспечивающие движение оплодотворенного яйца по трубе до матки. Zona pellucida состоит из гликопротеинов, секретируемыхрастущим ооцитом.
Мейоз возобновляется во время овуляции. Возобновление мейоза наблюдается после преовуляторного пика ЛГ. Мейоз в зрелом ооците связан с потерей ядерной мембраны, собиранием хроматина бивалентно, разделением хромосом. Мейоз завершается с освобождением полярного тельца во время фертилизации. Для нормального процесса мейоза необходима высокая концентрация эстрадиола в фолликулярной жидкости.
Мужские половые клетки в семенных канальцах в результате митотического деления образуют сперматоциты I порядка, которые проходят несколько стадий созревания подобно женской яйцеклетке. В результате мейотического деления образуются сперматоциты II порядка, содержащие половинное количество хромосом (23). Сперматоциты II порядка созревают до сперматид и, больше не подвергаясь делению, превращаются в сперматозоиды. Совокупность последовательных этапов созревания называют сперматогенным циклом. Этот цикл у человека совершается за 74 дня и недифференцированный сперматогоний превращается в высоко-специализированный сперматозоид, способный самостоятельно передвигаться, и имеющий набор энзимов, необходимых для пенетрации в яйцеклетку. Энергия для движения обеспечивается целым рядом факторов, включающих цАМФ, Са2+, катехоламины, белковый фактор подвижности, протеин карбоксиметилазу. Сперматозоиды, присутствующие в свежей сперме, неспособны к оплодотворению. Эту способность они приобретают, попадая в женский половой тракт, где теряют оболочечный антиген - происходит капацитация. В свою очередь, яйцеклетка выделяет продукт, который растворяет акросомальные пузырьки, прикрывающие головное ядро спермия, где находится генетический фонд отцовского происхождения. Полагают, что процесс оплодотворения происходит в ампулярном отделе трубы. Воронка трубы активно участвует в этом процессе, плотно прилегая к участку яичника с выдающимся на его поверхности фолликулом и, как бы, засасывает яйцеклетку. Под влиянием энзимов, выделенных эпителием маточных труб, яйцеклетка освобождается от клеток лучистого венца. Сущность процесса оплодотворения состоит в объединении, слиянии женской и мужской половых клеток, отъединившихся от организмов родительского поколения в одну новую клетку - зиготу, которая представляет собой не только клетку, но и организм нового поколения.
Спермий вносит в яйцеклетку главным образом свой ядерный материал, который и объединяется с ядерным материалом яйцеклетки в единое ядро зиготы.
Процесс созревания яйцеклетки и процесс оплодотворения обеспечиваются сложными эндокринными и иммунологическими процессами. Из-за этических проблем эти процессы у человека изучены недостаточно. Наши знания в основном получены из экспериментов на животных, имеющих очень много общего с этими процессами у человека. Благодаря развитию новых репродуктивных технологий в программах экстракорпорального оплодотворения были изучены стадии развития человеческого эмбриона до стадии бластоцисты in vitro. Благодаря этим исследованиям накопился большой материал по изучению механизмов раннего развития эмбриона, его продвижения по трубе, имплантации.
После оплодотворения зигота продвигается по трубе, претерпевая сложный процесс развития. Первое деление (стадия двух бластомеров) наступает лишь на 2-е сутки после оплодотворения. По мере продвижения по трубе в зиготе происходит полное асинхронное дробление, которое приводит к образованию морулы. К этому времени эмбрион освобождается от желточной и прозрачной оболочек и в стадии морулы зародыш поступает в матку, представляя собой рыхлый комплекс бластомеров. Прохождение по трубе является одним из критических моментов беременности. Установлено, что взаимоотношения между гомета/ранний эмбрион и эпителий маточной трубы регулируется аутокринным и паракринным путем, обеспечивая эмбрион средой, усиливающей процессы оплодотворения и раннего развития эмбриона. Полагают. что регулятором этих процессов является гонадотропный релизинг-гормон, продуцируемый как преимплантационным эмбрионом, так и эпителием маточных труб.
Эпителий маточных труб экспрессирует ГнРГ и ГнРГ-рецепторы как мессенжеры рибонуклеиновой кислоты (mRNA), так и протеинов. Оказалось, что эта экспрессия циклозависима и, в основном, появляется в процессе лютеиновой фазы цикла. На основании этих данных группа исследователей полагает, что ГнРГ труб играет значительную роль в регуляции аутокринным-паракринным путем в фертилизации, в раннем развитии эмбриона и вимплантации, так как в маточном эпителии в период максимального развития «окна имплантации» имеются в значительном количестве рецепторы ГнРГ.
Было показано, что ГнРГ, mRNA и экспрессия протеинов наблюдается у эмбриона, и она увеличивается по мере превращения морулы в бластоцисту. Полагают, что взаимодействие эмбриона с эпителием трубы и с эндометрием осуществляется через систему ГнРГ, обеспечивающего развитие эмбриона и рецептивность эндометрия. И опять многими исследователями подчеркивается необходимость синхронного развития эмбриона и всех механизмов взаимодействия. Если транспорт эмбриона по каким-то причинам может быть задержан, трофобласт может проявлять свои инвазивные свойства до поступления в матку. В этом случае может возникнуть трубная беременность. При быстром продвижении эмбрион поступает в матку, где еще нет рецептивности эндометрия и имплантация может не произойти, либо эмбрион задерживается в нижних отделах матки, т.е. в месте, менее подходящем для дальнейшего развития плодного яйца.
Имплантация яйцеклетки
В течение 24 часов после оплодотворения яйцеклетка начинает активное деление на клетки. Она находится в фаллопиевой трубе приблизительно три дня. Зигота (оплодотворенная яйцеклетка) продолжает делиться, медленно продвигаясь по фаллопиевой трубе к матке, где она присоединяется к эндометрию (имплантация). Сначала зигота превращается в скопление клеток, потом становится полым шаром клеток, или бластоцистой (зародышевым пузырем). Перед имплантацией бластоциста выходит из защитного покрытия. Когда бластоциста приближается к эндометрию, обмен гормонами способствует ее присоединению. У некоторых женщин возникают пятна или легкое кровотечение на несколько дней в период имплантации. Эндометрий становится толще и шейка матки изолируется при помощи слизи.
На протяжении трех недель клетки бластоцисти вырастают в скопление клеток, формируются первые нервные клетки ребенка. Ребенка называют эмбрионом с момента оплодотворения до восьмой недели беременности, после которой до самого рождения его называют плод.
Процесс имплантации может быть только в том случае, если поступивший в матку эмбрион достиг стадии бластоцисты. Бластоциста состоит из внутренней части клеток - эндодерма, из которого образуется собственно эмбрион, и наружного слоя клеток - трофоэктодерма - предшественника плаценты. Полагают, что на стадии преимплантации бластоциста экспрессирует преимплантационный фактор (PIF), сосудистый эндотелиальный, фактор роста (VEGF), а также mRNA и протеин к VEGF, что дает возможность эмбриону очень быстро осуществлять ангиогенез для успешной плацентации и создает необходимые условия для дальнейшего его развития.
Для успешной имплантации необходимо, чтобы в эндометрии появились все требуемые изменения дифференциации клеток эндометрия для появления «окна имплантации», которое в норме наблюдается на 6-7 день после овуляции и чтобы бластоциста достигла определенной стадии зрелости и были активированы протеазы, которые будут способствовать продвижению бластоцисты в эндометрий. «Рецептивность эндометрия - кульминация комплекса временных и пространственных изменений в эндометрии, регулируемая стероидными гормонами». Процессы появления «окна имплантации» и созревания бластоцисты должны быть синхронными. Если этого не произойдет, то имплантация не состоится или беременность прервется на ранних ее стадиях.
Перед имплантацией поверхностный эпителий эндометрия покрыт муцином, который предотвращает преждевременную имплантацию бластоцисты и защищает от инфекции, особенно Мис1 - episialin, играющий как бы барьерную роль в различных аспектах физиологии женского репродуктивного тракта. К моменту открытия «окна имплантации» количество муцина разрушается протеазами, продуцируемыми эмбрионом.
Имплантация бластоцисты в эндометрий включает два этапа: 1 этап - адгезия двух клеточных структур, и 2 этап - децидуализация стромы эндометрия. Чрезвычайно интересный вопрос, как эмбрион идентифицирует место имплантации, до сих пор остается открытым. С момента поступления бластоцисты в матку до начала имплантации проходит 2-3 суток. Предполагают гипотетически, что эмбрион выделяет растворимые факторы/молекулы, которые, воздействуя на эндометрий, подготавливают его к имплантации. В процессе имплантации ключевая роль принадлежит адгезии, но этот процесс, который позволяет удерживать две разные клеточные массы, чрезвычайно сложен. В нем принимает участие огромное количество факторов. Полагают, что интегрины играют ведущую роль в адгезии в момент имплантации. Особенно значимым является интегрин-01, его экспрессия увеличивается в момент имплантации. Однако интегрины сами по себе лишены энзиматической активности и должны быть связаны с протеинами для генерации цитоплазматического сигнала. Исследования, проведенные группой исследователей из Японии, показали, что небольшие гуанозин-трифосфат-связывающие протеины RhoA превращают интегрины в активный интегрин, который в состоянии участвовать в клеточной адгезии.
Помимо интегринов адгезивными молекулами являются такие протеины кактрофинин, бустин и тастин (trophinin, bustin, tastin).
Трофинин - мембранный протеин, экспрессируется на поверхности эпителия эндометрия в месте имплантации и на апикальной поверхности трофэктодермы бластоцисты. Бустин и тастин - цитоплазматические протеины в ассоциации с трофинином образуют активный адгезивный комплекс. Эти молекулы принимают участие не только в имплантации, но и в дальнейшем развитии плаценты. В адгезии принимают участие молекулы внеклеточного матрикса - остеокантин и ламинин.
Чрезвычайно большая роль отводится различным факторам роста. Особое внимание исследователи уделяют значению в имплантации инсулиноподобных факторов роста и связывающих их протеинов, особенно IGFBP. Эти протеины играют роль не только в процессе имплантации, но и в моделировании сосудистых реакций, регулировании роста миометрия. По данным Paria и соавт. (2001), значительное место в процессах имплантации играет гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), который экспрессируется как в эндометрии, так и в эмбрионе, а также фактор роста фибробластов (FGF), костный морфогенный протеин (BMP) и др. После адгезии двух клеточных систем эндометрия и трофобласта начинается фаза инвазии трофобласта. Клетки трофобласта выделяют ферменты-протеазы, которые позволяют трофобласту «протиснуть» себя между клетками в строму, лизируя внеклеточный матрикс ферментом металлопротеазой (ММР). Инсулиноподобный фактор роста II трофобласта является важнейшим фактором роста трофобласта.
В момент имплантации весь эндометрий пронизан иммунокомпетентными клетками - одним из важнейших компонентов взаимодействия трофобласта с эндометрием. Иммунологические взаимоотношения между эмбрионом и матерью в процессе беременности схожи с теми взаимоотношениями, которые наблюдаются в реакциях трансплантат-реципиент. Полагали, что имплантация в матку контролируется сходным путем, через Т-клетки, распознающие аллоантигены плода, экспрессируемые плацентой. Однако недавние исследования показали, что имплантация может вовлекать новый путь аллогенного распознавания, основанного на NK-клеткахскорее чем на Т-клетках. На трофобласте не экспрессируются антигены системы HLAI и II классов, но экспрессируется полиморфный антиген HLA-G. Этот антиген отцовского происхождения служит как молекула адгезии для CD8 антигенов больших гранулярных лейкоцитов, количество которыхувеличивается в эндометрии в середине лютейновой фазы. Эти NK-клетки с маркерами CD3- CD8+ CD56+ функционально более инертны в продукции с Тh1, связанными цитокинами такими как TNFcc, ИФН-у по сравнению с CD8- CD56+ децидуальными гранулярными лейкоцитами. Кроме того, трофобласт экспрессирует низкой связывающей способности (аффинности) рецепторы для цитокинов TNFa, ИФН-у и GM-CSF. В результате этого будет преимущественно ответ на плодовые антигены, обусловленный ответом через Th2, т.е. будет преимущественно продукции не провоспалительных цитокинов, а, напротив, регуляторных (il-4, il-10, il-13 и др.). Нормальный баланс между Th 1 и Th2 способствует более успешной инвазии трофобласта. Избыточная продукция провоспалительных цитокинов ограничивает инвазию трофобласта и задерживает нормальное развитие плаценты, в связи, с чем снижается продукция гормонов и протеинов. Кроме того, ТЫ цитокины усиливают протромбинкиназную активность и активируют механизмы коагуляции, вызывают тромбозы и отслойку трофобласта.
Кроме того, на иммуносупрессивное состояние влияют молекулы продуцируемые плодом и амнионом - фетуин (fetuin) и спермин (spermine). Эти молекулы подавляют продукцию TNF. Экспрессия на клетках трофобласта HU-G ингибирует рецепторы NK-клетоки таким образом также снижает иммунологическую агрессию против внедряющегося трофобласта.
Децидуальные стромальные клетки и NK-клетки продуцируют цитокины GM-CSF, CSF-1, аИНФ, TGFbeta, которые необходимы для роста и развития трофобласта, пролиферации и дифференциации.
В результате роста и развития трофобласта увеличивается продукция гормонов. Особенно существенным для иммунных отношений является прогестерон. Прогестерон стимулирует местно продукцию плацентарных протеинов, осо бенно протеина-TJ6, связывает децидуальные лейкоциты CD56+16+, вызывая их апоптоз (естественная гибель клеток).
В ответ на рост трофобласта и инвазию в матку до спиральных артериол у матери вырабатываются антитела (блокирующие), которые обладают иммунотрофической функцией и блокируют местный иммунный ответ. Плацента становится иммунологически привилегированным органом. При нормально развивающейся беременности этот иммунный баланс устанавливается к 10-12 неделям беременности.
Беременность и гормоны
Хорионический гонадотропин человека является гормоном, который возникает в крови матери с момента оплодотворения. Он вырабатывается клетками плаценты. Это гормон, который фиксируется тестом на беременность, однако, его уровень становится достаточно высок для определения лишь через 3-4 недели после первого дня последнего менструального цикла.
Стадии развития беременности называются триместрами, или 3-месячными периодами, из-за значительных изменений, которые происходят на каждой стадии.

Паракринные регуляторы имплантации
C.Simon, J.C.Martin, A.Pellicer
Bailliere’s Clin Obstet Gyn
Vol 14, No 5, pp. 815-826, 2000
Имплантация эмбриона, процесс ориентировки, прикрепления и инвазии человеческого зародыша к материнскому эндометрию имеет сложную регуляцию. Классические и современные исследования показали, что эндокринная регуляция гормонами яичника необходима для имплантации. Однако все больше фактов накапливается в пользу существования дополнительных паракринных процессов регуляции имплантации, основанных на реципрокных взаимодействиях эмбриона и матки. Более того, паракринные эффекторы оказывают также действия, характерные для стероидов.
Паракринная регуляция имплантации облегчает взаимодействие эмбриона, эпителиальных клеток эндометрия (ЭКЭ) и стромальных клеток эндометрия (СКЭ). Для болшей ясности мы структурировали эту главу на три раздела: эпителиально-стромальные взаимодействия, приводящие к повышению рецептивности эндометрия и его децидуализации, эндометриально-эмбриональные взаимодействия в фазе приближения и адгезии, и наконец эмбрионально-стромальные взаимодействия в фазе инвазии (рис. 1).
Рис. 1. Паракринные взаимодействия во время имплантации эмбриона. ЭКЭ и СКЭ после взаимодействия с гормонами меняют информацию, переходя в рецептивное состояние. Во время адгезии бластоцисты эмбрион и ЭКЭ синхронизируют свои взаимодействия. Наконец, когда эмбрион проникает в матку, необходим полноценный информационный обмен между СКЭ и имплантирующимся клеточным трофобластом.
Эпителиально-стромальные взаимодействия во время достижения рецептивности эндометрия и децидуализации
В эндометрии в предимплантационный период происходят морфологические и биохимические изменения, приводящие к сложным сигнальным взаимодействиям паракринных молекул, индуцируемые присутствием развивающейся бластоцисты. Стромальные клетки опосредуют пролиферативный эффект эстрогенов на эпителиальные клетки. Стероид-активируемые протеины, такие как недавно описанные протеины циклооксигеназы (СОХ), кальцитонин, гепарин-связывающий ЭФР — подобный фактор роста (ГС-ЭФР), лактоферрин, лейкемия-ингибирующий фактор (ЛИФ), интерлейкин-1 (ИЛ-1), могут регулировать паракринным путем пролиферацию эндометрия, секрецию и децидуализацию (рис. 2).
Рис. 2. Эпидермально-стромальные взаимодействия. Во время предимплантационного периода стероид-индуцируемые и секреторные молекулы играют роль паракринных регуляторов рецептивного статуса. СОХ регулирует образование простагландинов, железистая секреция контролируется калцитонином, который рассматривается в качестве маркера рецептивности эндометрия. Другие молекулы, секретируемые ЭКЭ, также вовлечены в паракринные взаимодействия, такие как ЛИФ, ГС-ЭФР, ИЛ-1.
Некоторые исследования показали, что простагландины, отвечая на материнские стероиды, могут влиять на процессы имплантации. Самым ранним признаком имплантации является повышение сосудистой проницаемости, что опосредуется простагландинами. Молекулы, ограничивающие скорость синтеза простагландинов, являются СОХ-ферментами. Существует 2 изоформы СОХ-протеина: СОХ-1 и СОХ-2. СОХ-1 – постоянный фермент, а СОХ-2 – индуцибельная форма. Эти ферменты являются продуктами двух разных структурных генов. У мышей, лишенных СОХ-2, наблюдались нарушения имплантации, а у мышей без СОХ-1 – нет. Во время окна имплантации СОХ-1 экспрессируется в основном в эпителии желез, а СОХ-2 — в периваскулярных клетках. Лечение антипрогестинами значительно снижает экспрессию СОХ-1 и СОХ-2. Экспрессия гена СОХ-2 связана с функцией ХГЧ. В настоящем исследовании ХГЧ и ЛГ повышали экспрессию гена СОХ-2 в человеческих эпителиальных клетках желез эндометрия. Эффект был время— и дозозависимым и гормоно-специфичным и был опосредован медиаторным путем протеин-киназы А. Эксперименты in vitro показали, что ИЛ-1-бета может индуцировать экспрессию гена СОХ-2 в культуре стромальных клеток эндометрия. Это поддерживает идею ИЛ-1 — опосредованного паракринного эффекта в контроле синтеза простагландинов во время предимплантационного периода.
Стероидная регуляция экспрессии гена кальцитонина вместе с паттерном экспрессии этого гена в матке обнауживает свойства кальцитонина как новой паракринной молекулой, вовлеченной в подготовку эндометрия к имплантации. У человека синтез пептидного гормона кальцитонина индуцируется прогестероном в железистом эпителии эндометрия только в середине секреторной фазы цикла, в ожидаемое время имплантации эмбриона. Точная функциональная роль кальцитонина в человеческом эндометрии пока неизвестна. Предполагается, что он может регулировать процесс имплантации бластоцисты путем регуляции кальциевого гомеостаза в матке аутокринно/паракринным путем.
ГС-ЭФР взаимодействует с рецептором, общим также для ЭФР и ТФР-альфа. Этот ЭФР-рецептора способен варьировать на протяжении менструального цикла – и в количестве самого белка и в количестве мРНК, связан с уровнем эстрадиола в сыворотке, но не зависит от уровня прогестерона. Эндометриальный ГС-ЭФР по-разному экспрессируется в стромальных и эпителиальных клетках в течение эндометриального цикла. У человека уровень ГС-ЭФР-протеина повышается в эпителиальных клетках во время пролиферативной фазы и снижается во время секреторной, максимальная экспрессия ГС-ЭФР в эпителии – в середине секреторной фазы. Предполагается и другая роль ГС-ЭФР в эндометриальных клетках – на основании повышения мРНК ГС-ЭФР после искусственной индукции децидуальной реакции стромальных клеток. Т.о. ГС-ЭФР может играть роль аутокринного/паракринного фактора в стимулировании пролиферации стромальных клеток после индукции децидуальной реакции. Секреция этого фактора роста в период рецептивности эндометрия, когда количество эптелиальных рецепторов к стероидным гормонам снижается, может регулировать вместе с другими паракринными модуляторами имплантацию бластоцисты.
Лактоферрин – это член семейства трансферринов: негемсодержащих железосвязывающих гликопротеинов, который опосредует межклеточные взаимодействия после стероид-регулируемой экспрессии. Этот протеин экспрессируется и секретируется первично в эпителиальных клетках. Плейотропные функции этого протеина включают в себя регуляцию роста клеток, дифференцировки и гомеостаза железа. Гормоны регулируют уровень лактоферрина ткане-специфичным способом. В репродуктивной системе экспрессия протеина индуцируется эстрогенами и подавляется во время имплантации после высвобождения прогестерона. Секретируемый в матке ЛИФ является ключевой молекулой имплантации. ЛИФ оказывает свои эффекты во время клеточной дифференцировки и имплантации путем димеризации рецепторных субъединиц: гликопротеина 130 и ЛИФ-рецептора-бета. У мышей ЛИФ необходим для осуществления прикрепления эмбриона и децидуализации эндометрия. В отсутствии ЛИФ эти события не присходят. Максимальная экспрессия этого протеина происходи в эндометрии во время ожидаемого окна имплантации в середине лютеиновой фазы. Поскольку ЛИФ экспрессируется также в эндометрии человека в зависимости от фазы менструального цикла, а также в человеческом эмбрионе, его роль в процессе имплантации у человека предполагается. Система ИЛ-1, модулирующая клеточную пролиферацию и дифференцировку, также представлена в эндометии человека. Различные исследования выявляли возможную роль цитокинов в паракринной регуляции процессов репродукции, хотя животные, лишенные ИЛ-1, оставались фертильными. На человеческих СКЭ было показано, что ИЛ-1бета снижает экспрессию пролактина и ИПФР-связывающего протеина-1, которая рассматривается как маркер децидуализации. Морфологический анализ клеток после лечения ИЛ-1бета выявил неполноценную децидуализацию.
Эмбрионально-эпителиальные взаимодействия в фазах приближения и адгезии
Эпителий эндометрия представляет собой монослой кубических клеток, которые могут образовывать контакт с трофэктодермальными клетками бластоцисты. Бластоциста получает доступ к своему естественному месту прикрепления (эндометрий) в течение узкого временного окна и при наличии специфического гормонального фона, в течение остального времени эндометрий невосприимчив для имплантации эмбриона. Молекулы адгезии и антиадгезии вовлечены в трансформацию невосприимчивого эндометрия в рецептивный. Было предположено, что во время имплантационного окна экспрессируются специфические молекулы адгезии, переводя эндометрий в рецептивный статус, а антиадгезивные молекулы присутствуют до и после окна, служа естественным барьером для имплантации. Человеческий эмбрион сам способен регулировать паракринным путем динамику экспрессии обоих типов молекул.
Интегрины – трансмембранные гетеродимеры, состоящие из двух субъединиц (альфа и бета), связанных нековалентными связями. Некоторые белки внеклеточного матрикса, включая фибронектин, витронектин и коллаген 4 типа, имеют участок RGD (Arg-Gy-Asp) для связывания интегринов, хотя имеются и другие последовательности-мишени для интегриновых взаимодействий. Экспрессия интегринов энодметрия гормонально зависима, интересно отметить, что стероид-индуцированные паракринные молекулы могут также влиять сами на гормональный контроль. Интегрины альфа1 и альфа4 регулируются уровнем прогестерона. Они появляются в начале продукции прогестерона, когда уровень энометриальных прогестероновых рецепторов (ПР достигает максимума. Наоборот, бета-3 интегрины появляются, когда уровень ПР низкий. Исследования на животных, лишенных интегринов, показали, что дефицит интегрина бета-1 у мышей не нарушает нормального развития эмбрионов до стадии бластоцисты, однако имплантация не происходит. При отстутствии интегринов альфа-4, альфа-5, альфа-6 нарушения имплантации не происходило.
Мы исследовали регуляцию экспрессии альфа-4, бета-3 и альфа-1 интегринов в человеческий ЭКЭ на белковом уровне и выявляли эмбриональные факторы, влияющие на этот процесс. Наши результаты продемонстрировали селективный эффект развивающегося человеческого эмбриона на экспрессию бета-3 интегринов в ЭКЭ, которая становится максимальной, когда человеческая бластоциста (в отличие от замершего зародыша) находится в одной культуре с ЭКЭ. Более того, эмбриональная система ИЛ-1 вовлечена в стимуляцию экспрессии бета-З интегрина в ЭКЭ (рис. 3). Т.о. эмбрион может индуцировать желаемый паттерн экспрессии интегринов эндометрием для собственной имплантации, что обновляет концепцию паракринных взаимоотношений между бластоцистой и эндометриальным эпителием. Другая интересная роль регуляции эмбриональным ИЛ-1 паракринных коммуникаций между эмбрионом и материнскими клетками заключается в упомянутом выше опосредовании эффекта СОХ-2 через ИЛ-1бета.
Рецептивный статус формируется за счет баланса между активацией молекул адгезии и присутствием естественного барьера для эмбриона в эпителиальном гликокаликсе. Муцины – это семейство высоко гликозилированных протеинов высокого молекулярного веса (200-500 кДа), представленное на поверхности человеческих эпителиоцитов. Наиболее изученным является MUC-1. Локус его гена находится в участке 21 длинного плеча хромосомы 1 (1q21). MUC-1 обладает свойствами интегрального мембранного белка с концевым карбоксильным участком, содержащим дегенеративные последовательности, трансмембранным доменом (гидрофобным) из 31 остатка аминокислот и цитоплазменным хвостом из 69 остатков. MUC-1 был определен в эндометрии, и его экспрессия колеблется в течение менструального цикла, более того, обнаружены вариации у различных биологических видов. У человека уровень мРНК MUC-1 повышается в ткани эндометрия от пролиферативной к секреторной фазе и снижается в поздней секреторной фазе. У пациенток с заместительной гормональной терапией не наблюдается вариаций с увеличением дозы или временем действия эстрадиола, однако при введении прогестерона уровень MUC-1 увеличивается в клетках околожелезистого эпителия по сравнению с железистым. MUC-1 присутствует в более низких концентрациях в секреторной фазе перед днем (пик ЛГ + 7), чем после этого дня. Возможным субстратом для связывания MUC-1 являются селектины, которые связывают сиалил-Льюис-х и сиалил-Льюис-а карбогидратный антигены, или межклеточные молекулы адгезии (ICAM-1), которые распознают эпитоп внеклеточного домена MUC-1. Неизвестно, присутствуют ли эти молекулы в составе трофобласта. Недавно у кроликов была показана паракринная негативная регуляция эмбрионом экспрессии MUC-1 эндометрием. У этого биологического вида гормональная регуляция MUC-1 очень похожа на таковую человека, что позволяет предположить, что здоровый эмбрион способен снизить экспрессию MUC-1.
У людей, при использовании in vitro модели адгезии эмбриона, экспрессия MUC-1 протеина, измеренная методом проточной цитофлуометрии с антителами BC-2 и HMFG-1, повышалась в присутствии эмбриона. М-РНК MUC-1, определяемая методом Nothern blot со специфической кДНК MUC-1 также повышалась в культуре ЭКЭ при добавлении бластоцист, в сравнении с чистой контрольной культурой. Эти результаты позволяют предположить, что человеческий эмбрион может увеличивать количество MUC-1 в плазматической мембране ЭКЭ. Поскольку прогестерон увеличивает уровень MUC-1 во время окна имплантации, и поскольку бластоциста сама повышает уровень этой молекулы в ЭКЭ, роль MUC-1 становится непонятной. То ли эта молекула является истинной молекулой анти-адгезии, то ли она служит в качестве первого участка прикрепления.
Когда бластоциста входит в полость матки, она инициирует сложные сигналы, которые регулируют имплантацию эмебриона. Необходимо отметить, что некоторые из паракринных молекул, присутствующих в матке в периимплантационный период, могут модулировать рецептивность эндометрия, участвуя во взаимодействиях между клетками эндометрия и бластоцистой. Такими молекулами являются выше описанные ГС-ЭФР и ЛИФ. Кроме опосредования взаимодействий между эпителиальными и стромальными клетками, взаимодействие ГС-ЭФР со своим рецептором кажется важным для осуществления диалога между материнским организмом и эмбрионом. Также возможно, что для осуществления полноценной имплантации нужен другой тип взаимодействий, например – прямой контакт (юкстакринные взаимодействия). На мышиной модели было описано, что ГС-ЭФР, кроме паракринной функции, еще может опосредовать клеточно-клеточные взаимодействия за счет трансмембранного домена.
Координированная регуляция апоптоза ЭКЭ, индуцированная бластоцистой
Эндометриальный эпителий служит барьером для имплантации эмбриона. Эта концепция была продемонстрирована в классическом эксперименте Cowell, который показал, что у мышей бластоциста может имплантироваться на любой стадии яичникового цикла при искусственном повреждении целостности эндометриального эпителия. Апоптоз – программированная клеточная гибель – при которой клетки совершают самоубийство, не вызывая воспалительных изменений в тканях, — является основным механизмом, объясняющим устранение эпителиального барьера для бластоцисты. Физиологическая или программированная клеточная гибель участвует в реализации функции яичников, физиологических изменений эндометрия, развитии зародыша перед имплантацией, механизме имплантации и образования плаценты.
В человеческом эндометрии пролиферация и апоптоз – противоположные механизмы в течение менструального цикла, между которыми поддерживается равновесие. Пролиферативная фаза характеризуется низким числом апоптотических клеток, в то время как во время секреторной фазы число этих клеток возрастает, достигая максимума в период менструации. Большинство апоптотических клеток присутствует в эпителии, в строме эндометрия их меньше. Искусственно вызываемый спад яичниковых гормонов тоже приводит к программированной гибели клетки энодметрия. Механизмом гибели 97,5% клеток эндометриального эпителия является апоптоз и только 2,5% — некроз.
Существуют доказательства роли местно регулируемого апоптоза в патогенезе ремоделирования ткани при децидуализации и имплантации бластоцисты у мышей, крыс и хомяков. У грызунов ультрастуктурные исследования продемонстрировали, что клетки маточного эпителия в участке прикрепления бластоцисты подвергаются апоптозу и фагоцитируются клетками трофоэктодермы во время инвазии. У мышей было показано, что аутокринно/паракринная регуляция апоптоза в клетках маточного эпителия у мышей индуцируется самим эмбрионом, эффект опосредуется ТФР-бета. Во время стромальной инвазии у крыс происходит прогрессивная и продолжительная индукция апоптоза в материнской ткани.
У человека индукция эмбрионом апоптоза ЭКЭ и способность преодолеть эпителиальный барьер критична для выживания эмбриона. Максимальная индукция апоптоза происходит в ЭКЭ в месте тесного контакта с бластоцистой и индуцируется этим контактом, опосредуется хотя бы частично за счет FasL-Fas— лигандной системы. FasL — лиганд клеточной гибели — присутствует в трофоэктодерме, 60% ЭКЭ содержат Fas, рецептор клеточной гибели, на апикальной поверхности клеток. Предварительные исследования по нейтрализации Fas-FasL системы в адгезионной модели с поляризованными человеческими ЭКЭ и мышиной бластоцистой (также продуцирующей FasL) выявили нарушения механизма адгезии эмбриона в культуре ЭКЭ в присутствии анти-CD95 (anti-Fas) по сравнению с культурой без anti-Fas. Это исследование позволяет предположить, что апоптоз ЭКЭ индуцируется эмбрионом и является важным механизмом, позволяющим эмбриону преодолеть эпителий эндометрия. В результате достигается прямой контакт трофоэктодермы с базальной мембраной и становится возможна стромальная инвазия.
Рис. 3. Эмбрионально-эпителиальные взаимоотношения. Когда эмбрион входит в матку, правильные взаимоотношения между бластоцистой и ЭКЭ необходимы для благополучной адгезии. Во-первых, эмбрион ориентируется и обменивается информацией с материнскими клетками с помощью местных секреторных молекл, таких как ИЛ-1 или ЛИФ. Далее другие факторы могут регулировать фазу адгезии паракринно/юкстакринными механизмами, например, взаимодействием между ГС-ЭФР и его рецептором, и индукцией апоптоза за счет взаимодействия FasL-Fas.
Эмбрионально-стромальные взаимоотношения в стадии инвазии
Децидуализация, процесс стромально-клеточной пролиферации и дифференцировки, инициируется яичниковыми гормонами в ожидаемое время имплантации. Стромальные клетки – фибробласто-подобные, отвечают на действие прогестерона своей дифференцировкой в децидуальные клетки с характерными изменениями морфологии и секреции пролактина – это общеизвестный маркер децидуализации «in vitro».
Инвазия – это самоконтролируемый протеолитический и иммунологический процесс. Базальная мембрана – первый барьер, который должен быть преодолен, далее трофобласт проникает в строму, уже децидуализированную и прорастает в материнские кровеносные сосуды. Этот эффект опосредуется некоторыми протеиназами, разрушающими внеклеточный матрикс: сериновые протеазы, металлопротеиназы, катепсины (Рис. 4). Урокиназный (уАП) и тканевой (тАП) активаторы плазминогена являются сериновыми протеазами, катализирующими превращение плазминогена в плазмин, обладающий широким протеолитическим действием; они способны напрямую разрушать внеклеточный матрикс. Матриксные металлопротеиназы (ММП) – это семейство цинк-зависимымых эндопептидаз с протеолитическими свойствами в отношении некоторых компонентов внеклеточного матрикса. Семейство состоит из трех групп: коллагеназы, желатиназы и стромелизины. Активированные ферменты разрушают внеклеточный матрикс соответственно их субстратной специфичности. Коллагеназы включают ММП-1 и ММП-8. Эти ферменты расщепляют коллаген типов 1, 2, 3, 7 и 10. Желатиназы расщепляют коллаген 4 типа и денатурированный колаген. Стромелизины разрушают фибронектин, ламинин, коллаген 4, 5 и 7 типа, а также протеогликаны. Регуляция этих процессов необходима для предотвращения избыточной патологической инвазии, происходящей при placenta accreta или дефективной инвазии при преэклампсии.
Классические исследования приводят к заключению, что децидуа может осуществлять протеолитический и иммунологический контроль над инвазией бластоцисты. Со своей стороны человеческая бластоциста может влиять на процесс. Гистологическое изучение эндометрия при нормальной беременности выявило специфические изменения в децидуа, индуцированные присутствием эмбриона. У макак резус исследователи также выявили изменения функционального слоя эндометрия в лютеиновой фазе в присутствии бластоцисты.
В двух крупномасштабных исследованиях на экспериментальных животных были продемонстрированы 2 пути тонкой паракринной регуляции взаимоотношений между децидуа и трофобластом. Влияние трофобласта моделировалось введением фермента, расщепляющего триптофан, — индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), экспрессируемого трофобластом. Транскрипция IDO начинается в мышином трофобласте во время инвазии, фармакологическое блокирование IDO вызывает быстрое Т-клеточно-индуцированное разрушение эмбриона. Роль децидуа демонстрируется у самок мышей с гомозиготной мутацией, приводящей к отсутствию альфа-цепи рецептора ИЛ-11. Эти мыши бесплодны из-за нарушенного процесса децидуализации. Постимплантационный ответ децидуа на внедряющуюся бластоцисту нарушается из-за отсутствия полноценного рецептора к ИЛ-11 в развивающихся децидуальных клетках, что доказывает его важное участие в паракринной регуляции взаимоотношений децидуа и трофобласта.

Рецептивность эндометрия и окно имплантации
B.A.Lessey
Baillier’s Clin Obstet and Gyn, 2000, Vol 14, No 5, pp 775-588
Имплантация – это одно из интереснейших биологических событий. Этот процесс различается у разных видов млекопитающих. У человека имплантация гемохориальная, поскольку эмбрион тесно взаимодействует с материнским кровообращением во время образования плаценты. Клеточные механизмы, вовлеченные в процесс имплантации человеческого зародыша, включают поверхностное взаимодействие материнского и эмбрионального эпителиев, проникновение клеток эмбриона между материнскими эпителиоцитами, инвазию трофобласта глубоко в эндометрий. В этой главе рассматривается состояние рецептивности эндометрия и регуляция им процесса имплантации.
С демографической точки зрения имплантация – обычное событие для нашего вида. В 1999 г количество людей на Земле достигло 6 миллиардов, что является доказательство эффективности репродукции человека. Процесс имплантации, тем не менее, весьма уязвим и требует соблюдения ряда условий: высокой степени синхронности между эндометрием и эмбрионом, адекватного гормонального окружения, нормальных анатомических условий и функции половых клеток. Принимая во внимание сложность процесса, становится неудивительным факт частых неудач имплантации. С клинической точки зрения эти неудачи становятся все более значимой проблемой. Бесплодие встречается в среднем у каждой шестой пары, и этот процент продолжает расти.
Имплантация
Процесс имплантации подразделяется на стадии, основанные на этапах развития эмбриона и происходящих взаимодействиях с материнским организмом. Начало процесса включает оплодотворение яйцеклетки сперматозоидом в маточной трубе – 1 стадия имплантации. Образовавшийся эмбрион продолжает делиться и развиваться, двигаясь по направлению к матке – стадия 2. На стадии 3 морула входит в полость матки, дальнейшее деление клеток приводит к формированию бластоцисты.
У человека полная последовательность событий, приводящих к имплантации, занимает небольшой промежуток времени. Эмбрион входит в полость матки через 72-96 часов после оплодотворения. Эндометрий, чей рост и развитие стимулировались эстрогенами растущего фолликула, подвергается секреторной трансформации в ответ на повышение уровня прогестерона и пептидных гормонов свежего желтого тела. Гормональные и паракринные влияния яичников и эндометрия приводят к характерным изменениям эндометрия, повышающим его рецептивность к последующей нидации бластоцисты.
Хэтчинг эмбриона с разрушением блестящей оболочки происходит на 5 день (через 10-120 часов после овуляции). Исчезновение блестящей оболочки обнажает рецепторы, молекулы клеточной адгезии, матриксные металлопротеиназы и компоненты внеклеточного матрикса, которые вовлекаются в следующий этап имплантации. 4 стадия включает в себя короткий этап противостояния (аппозиция). У человека трудно изучить эту стадию в прямом эксперименте, поэтому ее точная продолжительность и механизмы остаются неизученными до конца. Аппозиция быстро сменяется инвазией (стадия 5). Присутствие специфических белков на апикальном полюсе эндометрия и на поверхности эмбрионального эпителия позволяет предположить, что аппозиция и прикрепление опосредуются различными молекулами клеточной адгезии и/или компонентами внеклеточного матрикса. Соприкосновение с подлежащей базальной мембраной эндометрия может запустить продукцию пищеварительных ферментов, расщепляющих эту преграду, и обнажить подлежащую строму.
Почему клетки бластоцисты резко приобретают мобильные и инвазивные свойства, непонятно, но возможно эти изменения фенотипа запускаются за счет активации клеточных рецепторов эндометрия. Известно, что это именно диалог, т.е. взаимодействия направлены в обе стороны и включают активацию сигнальных механизмов как в эндометрии, так и у эмбриона. Разрушенные при начале инвазии фрагменты эндометриального или трофобластического внеклеточного матрикса, возможно, стимулируют дальнейший процесс путем активации специфических матриксных металлопротеиназ. Расположение определенных интегринов на поверхности цитотрофобласта, возможно, тоже способствует приобретению миграционного фенотипа.
Проникновение трофобласта между клетками эндометрия возможно облегчается за счет потерей клетками некоторых молекул адгезии со своей поверхности в середине секреторной фазы, что приводит к нарушениям контактов между клетками эндометрия. Такая возможность подтверждается данными иммуногистохимического исследования уровня интегринов. Уровень Е-кадгеринов, обеспечивающих контакты между клетками эндометрия, тоже снижается в середину лютеиновой фазы. Синтез и функционирование этих молекул адгезии регулируется уровнем гормонов в эндометрии и зависит от концентрации кальция. Кроме того, специфические цитокины мгут приводить к разрушению Е-кадгеринов и полной потере их функции.
Параллельно с продолжающимся ростом у эмбриона увеличиваются потребности в питательных веществах и усложняется система регуляции. Т.о. инвазия в материнский кровоток становится приоритетной задачей. Эта стадия имплантации сопровождается быстрой экспансией как цито-, так и синцитиотрофобласта. На стадии 5а материнские кровеносные сосуды все еще остаются интактными, но они окружены внедряющимся многоядерным синцитием. Далее синцитий и отдельные клетки цитотрофобласта внедряются в материнские кровеносные сосуды, и синцитиотрофобласт встраивается в их стенку. Способность эмбриональных тканей подстроиться под характеристики материнских эндометриальных клеток (аналогичная экспрессия интегринов) критична для данной стадии, она позволяет эмбриону получить доступ к стабильному кровоснабжению на оставшийся период беременности, не вызывая защитной реакции материнского организма.
Стадия 5б характеризуется экспансией синцитиотрофобласта и цитотрофобласта и образованием лакун в результате сосудистой инвазии. На стадии 5с эмбрион полностью погружен в эндометрий, его окружает слой синцитиотрофобласта, очень скоро сформирующий ворсины хориона (рис. 1, А и В).
Развитие хориона и стадия 5 заканчивается приблизительно на 11-12 день после овуляции образованием первичных ворсин.
Биомаркеры и окно имплантации
Имплантация у мышей происходит вечером четвертого дня после полового акта – изучено на имплантационной модели беременных самок после овариаэктомии с ежедневными инъекциями прогестерона. Точно известное время иплантации вызывалось у таких животных путем инъекции небольших количеств экзогенного эстрадиола (?). Эта модель достаточно полезна для изучения процесса имплантации, и многие регуляторные пептиды были впервые охарактеризованы с ее помощью.
Значительное продвижение нашего понимания процесса имплантации было достигнуто за счет использования мышей с направленными мутациями (отсутствием того или иного гена). Отсутствие одних генов было критично для всего процесса имплантации, в то время как мутации других генов (ранее рассматривемых как необходимых) не оказывало повреждающего эффекта. Следующие примеры описывают несколько наиболее известных маркеров, изучаемых в контексте теории имплантации.
CSF-1 (колониестимулирующий фактор-1)
КСФ-1 – это ростовой фактор, экспрессируемый фибробластами, моноцитами, макрофагами и эндотелиоцитами. Он экспрессируется эндометриальным эпителием и стромальными клетками, а также клетками трофобласта, в то время как рецептор к нему, прото-онкоген c-fms, экспрессируется на эмбриональных клетках. Мутантные мыши, не имеющие КСФ-1, – бесплодны. Опыты позволяют предположить, что бесплодие в данном случае связано именно с нарушением процесса имплантации. Kauma et al определяли уровень КСФ-1 в течение менструального цикла и выявили его повышение в районе 22 дня и значительное увеличение как фактора, так и рецептора к нему в конце секреторной фазы и в ранние сроки беременности. Конкретная функция фактора неясна, однако этот цитокин считается жизненно необходимым для имплантации.
ЛИФ (лейкемия-ингибирующий фактор)
Исходно было известно влияние ЛИФ на дифференцировку клеточной линии миелолейкоза MI, однако наибольший нтерес представляет его участие в процессе имплантации. ЛИФ присутствует в матке мышей, достигая максимального уровня экспрессии к 4 дню беременности. На моделях с отложенной имплантацией было показано, что рецептивность матки, связанная с инъекцией эстрадиола, также коррелирует с экспрессией ЛИФ. Самки-гомозиготы, не экспрессирующие ЛИФ, бесплодны из-за нарушения процессам имплантации, в то время как самцы сохраняют репродуктивную способность.
Исследования на людях подтвердили значимость ЛИФ, показав его присутствие в эндометрии во время имплантации. Введение ЛИФ эмбрионам оказало благоприятный эффект на их качество и повысило процент эмбрионов, достигших стадии бластоцисты. Sawai et al показали, что ЛИФ повышает продукцию ХГЧ, и что эффект ЛИФ на дифференцировку трофобласта может блокироваться антителами к ХГЧ. Мы обнаружили присутствие ЛИФ у женщин во время окна имплантации, а также факт снижения экспрессии в эндометрии у некоторых женщин с бесплодием. Создается впечатление необходимости ЛИФ для децидуализации – у мышей, лишенных этого фактора, полноценной децидуализации не происходило. ЛИФ отсутствовал у мутантных мышей, лишенных гена Hoxa-10. Интересно отметить, что у женщин с энодметриозом снижена экспрессия этого гена. Перитонеальная жидкость пациенток с эндометриозом снижала частоту имплантации и уровень экспрессии ЛИФ во время окна имплантации у мышей. Децидуализация регулируется различными способами. Один из ее маркеров – пролактин – регулируется яичниковыми гормонами, другие же гормоны, включая интегрины, регулируются факторами роста и/или цитокинами. Известно, что одним из регуляторов является простагландин Е2. Экспрессия 2 подтипов рецепторов к нему – Ер-3 и Ер-4 в строме матки у Hoxa10 -/— мышей нарушена. ИФР-СП-1 и гликоделин (РРI2, PPI4)
Многие белки, экспрессирующиеся в матке, первоначально были описаны как плацентарные протеины, потом выяснилось, что их выделение из плацентарной ткани вызвано децидуальной контаминацией образцов. РРI2, сегодня известный как ИФР-связывающий протеин-1 (ИФР-СП-1), и PPI4, сегодня называемый гликоделин, являются двумя основными белковыми продуктами эндометрия. ИФР-СП1 образуется в строме и децидуа и играет роль в регуляции плацентарной инвазии. Гликоделин – белок. Секретируемый железистым эпителием, он может играть роль иммуномодулятора и блокировать взаимодействие сперматозоидов и яйцеклетки после окна имплантации.
Интегрины и другие молекулы клеточной адгезии
До последнего времени наиболее изученными маркерами рецептивности эндометрия были интегрины. Как во всякой другой ткани, существуют интегрины, выполняющие связующую роль между клетками и экспрессирующиеся постоянно. В эндометрии это следующие интегрины: альфа2бета1, альфа3бета1, альфа6бета1 и альфа6бета4, а также стромальный рецептор фибронектина альфа5бета1. Кроме того, имеется несколько интегринов, чья экспрессия зависит от фазы менструального цикла. Паттерн экспрессии альфа1бета1 (рецептор коллагена), альфа4бета1 (рецептор фибронектина) и альфабета3 (рецептор витронектина) представлен на рис.2: совместная экспрессия всех трех интегринов происходит только в течение окна имплантации (20-24 дни менструального цикла).
Ранее мы продемонстрировали, что отсрочивание экспресии альфабета3 коррелирует с дефектами лютеиновой фазы и может приводить к нарушениям репродукции в различных клинических проявлениях. Однако противоречивые результаты исследований позволяют отвести интегринам лишь дополнительную роль в регуляции рецептивности эндометрия, и делать вывод о состоянии рецептивности исключительно по уровням интегринов – неправильно.
При необъяснимом бесплодии наблюдаются нарушения экспрессии интегринов. Кроме обнаруженнной ранее корреляции с дефектами лютеиновой фазы, мы выявили взаимосвязь отсрочивания или полного прекращения экспрессии альфабета3 с эндометриозом, СПКЯ, гидросальпинксом и патологией труб. Каждый из этих диагнозов ассоциирован с низким уровнем имплантации в процессе ВРТ. Использование подобного молекулярного маркера позволит отобрать пациентов с более благоприятным ожидаемым результатом ВРТ.
У животных экспрессия интегринов наблюдается на 2 недель дольше, чем у человека – она продолжается после прикрепления эмбриона, но до инвазии плаценты.
Другие молекулы клеточной адгезии также могут играть важную роль в процессе имплантации. Раньше маркером рецептивности эндометрия считался альфа6бета4 интегрин, но недавние исследования показали, что его экспрессия постоянна и не меняется в зависимости от фазы цикла и окна имплантации, поэтому его использование в качестве маркера рецептивности бесполезно.
Другие факторы, могущие рассматриваться в качестве маркеров рецептивности
Кальцитонин – это гормон, вовлеченный в регуляцию кальциевого гомеостаза и традиционно рассматривающийся как продукт щитовидной железы. Факт производства кальцитонина рецептивным эндометрием у крыс многих удивил. Эндометрий мышей не продуцирует кальцитонин. У человека эндометриальный кальцитонин экспрессируется во время окна имплантации – между 20 и 24 днем цикла и возможно осуществляет паракринную регуляцию развития эмбриона.
Гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (ГС-ЭФР) является одной из многих ЭФР-подобных молекул, экспрессируемых близко к окну имплантации, он экспрессируется в эндометрии человека непосhественно перед этим окном. ГС-ЭФР состоит из секретируемой и мембрано-связанной форм. Мембрано-связанная форма связывается с эмбриональным ЭФР-рецептором Erb-4 и способствует прикреплению и дифференцировке эмбриона. Добавление ГС-ЭФР улучшает качество человеческих эмбрионов в цикле ВРТ и может являться паракринным фактором, стимулирующим другие маркеры рецептивности в человеческом эндометрии.
Имеется несколько факторов, которые, основываясь на результатах исследования мутантных мышей, можно считать жизненно необходимыми для имплантации. 2 из них являются продуктами транскрипции генов Hoxa10 и 11. Оба экспрессируются в эндометрии в циклическом режиме, у мутантов, не имеющих этих факторов, имплантация нарушена. У человека оба фактора экспрессируются во время окна имплантации, и недостаток обоих наблюдается при различных видах бесплодия. Многие считают эти факторы основными регуляторами, влияющими на синтез остальных факторов рецептивности эндометрия.
Рецептор к прогестерону (ПР) – фактор, широко изучающийся в контексте рецептивности эндометрия. В нормальном цикле эндометрий экспрессирует ПР во время пролиферативной фазы, и наблюдается снижение экспрессии в середине лютеиновой фазы. Это подавление экспрессии эпителиального ПР во время имплантации – постоянная находка у млекопитающих, описанная у многих видов – от овец до мышей. Мы считаем, что подавление экспрессии эпителиального ПР позволяет переключить регуляцию с системной (яичниковыми стероидами) на паракринную (продуктами стромы эндометрия). Персистенция ПР при неадекватной лютеиновой фазе сочетается с потерей других маркеров рецептивности. Коррекция этого дефекта приводит к восстановлению нормального паттерна экспрессии других белков (рис. 3).
Состояние проблемы. Место методов вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия
Проблема бесплодия не является отличительной чертой нашего столетия — она стара как мир. Так, уже в Библии упоминалось о бесплодных женщинах (Lunenfeld B., 1995). В то время верили, что плодовитость — это дар Господа, который можно получить или которого можно лишиться. Бесплодный брак остается одной из важнейших медицинских, социальных, экономических и общегосударственных проблем. По данным ВОЗ, его частота составляет 10–15 % и не имеет тенденции к снижению. Недостаточная эффективность методов восстановления естественной фертильности человека стимулировала развитие новых технологий, в том числе оплодотворения in vitro с последующим переносом эмбрионов в полость матки. Впервые метод был применен для лечения трубного бесплодия. Первая беременность, полученная после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), была внематочной (Steptoe P.C., Edwards R.G., 1976). Это знаменательное событие произошло в 1976 году благодаря научно-практическим исследованиям ученых P. Steptoe, R. Edwards, которые позднее, в 1978 году, получили первую маточную беременность после ЭКО. Эта беременность закончилась срочными родами (Steptoe P.C., Edwards R.G., 1978).

С этого момента началась новая эра в репродуктивной медицине. Суть метода ЭКО состоит в том, что из преовуляторных фолликулов аспирируются яйцеклетки, оплодотворяются сперматозоидами в лабораторных условиях, а полученные эмбрионы после короткого культивирования вне организма переносятся в полость матки пациентки. Метод прошел длительную эволюцию. Постоянно совершенствуются схемы и препараты для контролированной гиперстимуляции яичников, лабораторное оснащение и культуральные среды для эмбрионов, аппаратура для мониторинга роста фолликулов и забора яйцеклеток.

Возрастающий интерес к развитию вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) во всем мире обусловлен приоритетностью проблемы бесплодия в репродуктивной медицине. Ее социальное значение в нашей стране определяется неблагоприятной демографической ситуацией, в связи с чем сохранение и предупреждение нарушений репродуктивной функции населения приобрели в течение последних двух десятилетий первостепенное государственное значение. Однако, несмотря на большое количество поистине революционных достижений в этой сфере, результативность лечения бесплодия методом ЭКО колеблется от 20 до 60 % и редко преодолевает рубеж 30 % (Detsches IVF register, 1999). Стандартным методом контроля роста фолликулов в программах ЭКО является двухмерная, трансвагинальная эхография (ТВЭ) (Волик Н.К., 1999).

Основным диагностическим критерием оценки состояния эндометрия при 2D ТВЭ является его толщина (Kovach P. еt al., 2003). Эхографическая толщина эндометрия отображает степень подготовки эндометрия эстрогенами. Доказано, что в случаях, когда толщина эндометрия менее 5 мм, имплантация не происходит и перенос эмбрионов лучше не производить (Zaidi J. et al., 1995). В литературе описаны лишь единичные случаи наступления беременности, когда толщина эндометрия в циклах ЭКО была менее 5 мм (Sundstrom P., 1998).

Толщина эндометрия в пределах 5–7 мм является субоптимальной, то есть имплантация возможна, но ее вероятность низка по сравнению с толщиной эндометрия выше 7 мм. Идеальной толщиной эндометрия считается 9–12 мм (Zaidi J. et al., 1995). Часть исследователей отмечает лучший прогноз ЭКО-программ в случаях, когда толщина эндометрия не более 10 мм, в работах других авторов это не нашло подтверждения (Diettrich C. et al., 2002). Эхогенность эндометрия изменяется на протяжении менструального цикла. В фазе пролиферации эндометрий имеет так называемую трехлинейную — С-структуру. Повышение эхогенности эндометрия (В- и А-структура) в день назначения разрешающей дозы хорионического гонадотропина (ХГ) ассоциируется с низкой вероятностью имплантации, плохим прогнозом наступления беременности (Судома И.А. и др., 2004).

Классическими критериями зрелости фолликулов в циклах ЭКО при эхографии являются размер фолликулов и/или их объем (Brinsden P.R., 2005).

Считается, что при наличии 2–4 доминантных фолликулов от 16 до 22 мм можно назначать триггерную дозу хорионического гонадотропина.

В последние годы с целью мониторинга циклов ЭКО начали применять допплерографию. Кровоток в маточных артериях был впервые использован как маркер рецептивности эндометрия (Goswamy et al., 1998). Позднее в работах многочисленных авторов была доказана коррелятивная связь маточного и яичникового кровотока с фолликулогенезом и результативностью циклов ЭКО (Федорова Е.В., 2002).

По-прежнему спорным вопросом остается оптимальное время выполнения допплерографии. Часть исследователей оценивают маточный кровоток перед началом стимуляции гонадотропинами, другие авторы — в день назначения хорионического гонадотропина, в день забора ооцитов или в день переноса эмбрионов в полость матки. Нерешенным остается вопрос возможности отсрочки или отказа от переноса эмбрионов, если показатели маточного кровотока показывают, что имплантация маловероятна. Считается, что если достигнут пограничный уровень показателей допплерографии, прогноз нерецептивности эндометрия матки имеет специфичность (96–100 , положительный прогностический уровень (88–100 , однако низкую чувствительность (13–35 и низкое негативное прогностическое значение (44–56 (Friedler S. et al., 2006).

Несмотря на то что спиральные артерии имеют большое значение в обеспечении маточной перфузии, лишь небольшое количество работ посвящено их изучению (Kupesic S. е t al., 2002). Appelbaum (1998) описал 4 типа визуализации сосудов при допплерографии: 0 — сосуды визуализируются только в зоне миометрия; 1 — сосуды проникают за гиперэхогенный край эндометрия; 2 — сосуды достигают внутреннего гиперэхогенного края; 3 — сосуды достигают внутреннего края эндометрия (Appelbaum M., 1998). По данным авторов, отсутствие сосудов в эндометриальной зоне является абсолютным показателем негативного имплантационного прогноза, а у пациенток с проникновением сосудов к внутреннему краю эндометрия было получено наибольшее количество беременностей. Однако достоверной корреляции прогноза цикла ЭКО с параметрами кровотока и толщиной эндометрия авторам установить не удалось.

В последние годы появились работы, в которых показано, что способность ооцита к оплодотворению и дальнейшему росту и развитию эмбриона зависит не столько от размеров фолликула, сколько от его кровоснабжения (Bori-ni A. еt al., 2004). Так, в исследованиях A. Borini и соавт. было доказано, что количество полученных ооцитов достоверно коррелирует с индексом васкуляризации фолликулов (количество васкуляризированных фолликулов/общее количество фолликулов). Качество полученных эмбрионов коррелирует с PSV, в 70 % случаев при значении PSV более 10 см/с вероятно получение эмбрионов хорошего качества с высоким имплантационным потенциалом. J. Van Blerkom и соавт. в 2000 году доказали, что ооциты с дефектами цитоплазмы и эмбрионы с мультинуклеарными бластомерами происходят из фолликулов в состоянии гипоксии с плохим кровотоком. Гипоксия приводит к высокой частоте хромосомных аберраций. В этом исследовании был выявлен высокий индекс корреляции между фолликулярным кислородом, эндотелиальным сосудистым фактором роста и данными цветной допплерографии яичников в день назначения ХГ. Все эти показатели не зависели от размера фолликулов, то есть фолликулы одного размера могут иметь различный уровень насыщения кислородом. Авторы полагают, что фолликулы с интенсивным допплерографическим сигналом и перифолликулярным индексом резистентности менее 0,5 имеют высокий уровень кислорода (Van Blerkom J., 2000).

Разработка метода ЭКО вывела проблему лечения трубного бесплодия из тупика и позволила добиться наступления беременности у большого числа женщин, ранее обреченных на бездетность. Однако, согласно современным научным данным, среди супружеских пар, обращающихся с целью проведения программы ЭКО и переноса эмбрионов (ПЭ), большинство женщин и мужчин имеют отклонения в функциональном состоянии репродуктивной системы (Кулаков В.И., 2006; Адамян Л.В., 2006).

У данного контингента пациенток выявлена высокая распространенность субклинических и клинических форм эндокринопатий (91,7 , в том числе нарушения пролактиносекретирующей и соматотропной функции гипофиза (30–40 , функционального состояния щитовидной железы (до 50 и коры надпочечников (до 50 .

В последние годы метод ЭКО-ПЭ все более широко применяется для лечения бесплодия у женщин с различными гинекологическими заболеваниями: наружным и внутренним эндометриозом, миомой матки, поликистозными яичниками и др. (Адамян Л.В., 2006).

Исходя из этих данных, проблема бесплодия в программе ЭКО должна рассматриваться применительно к репродуктивному здоровью супружеской пары в целом. Подобный подход меняет стратегию отбора и последующей подготовки к ЭКО супружеской пары с обязательной предварительной оценкой состояния репродуктивной системы каждого из супругов (Кулаков В.И., 2006).

Феномен наступления беременности. Имплантационные механизмы. Основные механизмы нарушения имплантации
Наступление беременности состоит из двух основных этапов:

1. Оплодотворение яйцеклетки, развитие и транспорт эмбриона. В программе ЭКО эти механизмы представлены контролированной гиперстимуляцией яичников, забором, оплодотворением ооцитов и культивированием эмбрионов in vitro.

2. Имплантация бластоцисты.

Подчас очень трудно ответить на вопрос, почему у некоторых пар имеются повторяющиеся неудачные попытки ЭКО. За редким исключением, большинство практических врачей объясняют повторяющиеся или необъяснимые неудачные попытки ЭКО плохим качеством эмбрионов, однако качество эмбрионов зависит в основном от качества гамет: зрелости цитоплазмы, целостности веретена деления ооцита; морфологии, подвижности и состояния ДНК спермы.

Качество ооцита — главный фактор, ограничивающий успех, так как именно в ооците происходят сложные трансформации, приводящие к появлению эмбриона. Половая клетка ооцит готовится к этому процессу в результате диалога с соматическими клетками гранулезы фолликула. В то же время извлечение ооцита путем пункции фолликула во время ЭКО значительно уменьшает этот диалог и изменяет развитие эмбриона in vitro (Antczac M., Van Blerkom J., 1997).

При беременности, наступившей естественным путем, очень большое значение имеет микроокружение эмбриона на разных стадиях его развития.

Фолликулярная жидкость

Фолликулярная жидкость участвует в заключительных этапах созревания ооцитов в фолликулах и трубах. Перед овуляцией фолликулярная жидкость контролирует последние транскрипционные и посттранскрипционные изменения, которые позволят эмбриону осуществить синтез белков на протяжении первых этапов деления и сегментации. Абсолютная роль фолликулярной жидкости в настоящее время мало изучена. Многочисленные факторы роста и цитокины присутствуют в преовуляторном фолликуле.

Пока что их роль глубоко не изучена.

Трубный и маточный секрет играет очень важную роль в развитии эмбриона. В течение 130–140 часов вплоть до самой имплантации эмбрион окружен этим секретом.

Трубная жидкость

Микроокружение эмбриона в трубе не является анатомически гомогенным. Различные анатомические участки трубы, вероятнее всего, имеют свою собственную секрецию. В то же время присутствие эмбриона модулирует эту секрецию. Эмбрион подает специфические сигналы для того, чтобы регулировать свой путь в матку (Barnea E.R., 2001; Grandolfi F., 1995; Noda Y., 1993; Ortiz M.E., 1986).

Биохимическое и иммунологическое равновесие, также как и анатомическое единство трубы нарушается инфекционной агрессией или воспалением (Dalton T. et al., 1994).

Микроокружение эмбриона в полости матки

К моменту входа эмбриона в полость матки объем секреции очень незначителен (несколько десятков микролитров), этот объем уменьшается параллельно увеличению секреции прогестерона. Клинические исследования с применением промывки полости матки в момент пункции яйцеклеток показывают, что выявление неадекватной секреции цитокинов, в частности интерлейкина-18 и фактора, ингибирующего лейкемию (ФИЛ), является признаком неадекватной рецептивности матки и позволяет предсказать потенциальное нарушение имплантации независимо от качества эмбрионов (Ledee-Bataille N., 2002).

После оплодотворения трудно изменить развитие эмбриона на ранних стадиях. Но существуют также и другие, не эмбриональные причины неудач, на которые, к счастью, в большинстве случаев можно влиять. Эти факторы следующие:

1) возраст женщин и иногда мужчин;

2) проблемы рецептивности матки, зависящие от состояния слизистой;

3) техника переноса эмбрионов (Chehab F.F., 1996).

Перед каждой попыткой ЭКО эти факторы должны быть определены.

Фолликулярный резерв яичников и качество ооцитов очень тесно взаимосвязаны между собой. Некоторые женщины рождаются с редуцированным запасом фолликулов, и снижение фертильности у них бывает очень ранним. К сожалению, на данном этапе этот процесс не поддается коррекции и предлагаемые различные протоколы стимуляции яичников (замена агонистов GhRH антагонистами, увеличение дозы ФСГ или чМГ) не улучшают прогноз.

В настоящее время уже уменьшилась спекуляция противопоставления ЭКО со стимуляцией суперовуляции получению яйцеклеток в естественном цикле. Сторонники применения ЭКО в естественном цикле полагают, что природа поступает лучше, чем мы (иногда это действительно так, но, к сожалению, чаще всего — если женщина молода).

Сторонникам спонтанного цикла необходимо напомнить, что 52 % ооцитов у молодых, нормально отвечающих женщин дисморфны (имеются нарушения морфологии) (Alikani M., 1995).

Что в этом случае можно думать о женщинах более старшего возраста, с тотальной недостаточностью яичников с точки зрения увеличения цитогенетической аномалии. Полученные в этом случае эмбрионы в большинстве случаев анэуплоидны (70–80 % после 42 лет) (Van Blerkom J., 2000). В этих случаях не нужно спекулировать тем, что высокие дозы ФСГ увеличат пропорцию нормальных ооцитов, это просто необоснованные психологические и материальные затраты.

Эндометриальные маркеры имплантации эмбриона человека. Рецептивность эндометрия
С развитием ВРТ многие пациентки, прежде считавшиеся безнадежно бесплодными, получили возможность зачать. Завершающим этапом всех процедур экстракорпорального оплодотворения ЭКО является имплантация бластоцисты после переноса женщине ее эмбриона. Сегодня хорошо известно, что успех имплантации зависит от временного соотношения между стадией развития эмбриона и периодом рецептивности эндометрия. Изучение особенностей функции и ультраструктуры эндометрия у человека в период имплантации занимало многих исследователей. Эндометрий подвергается постоянным изменениям в течение менструального цикла под воздействием эстрогенов и прогестерона в соответствии с изменениями их концентрации. Для успешного наступления имплантации развитие эндометрия и эмбриона должно быть синхронным. Можно предположить, что эмбрион, в свою очередь, также каким-то образом способствует созреванию эндометрия. Нарушения этого баланса могут изменить восприимчивость эндометрия и нарушить процесс имплантации.

Все внутриматочные повреждения нарушают рецептивность эндометрия. Все инфекционные и воспалительные заболевания, даже субклинические, обладают повреждающим эффектом. Инфекция является одной из главных причин как перинатальных осложнений, так и нарушений имплантации. Может ли в этом случае простая диагностическая гистероскопия с последующим антибактериальным или противовоспалительным лечением изменить прогноз неудачных попыток ЭКО и необъяснимого привычного невынашивания?

Кроме того, аденомиоз, субмукозная миома матки, многочисленные циклы индукции овуляции кломифена цитратом могут нарушить имплантацию. Учитывая, что имплантация эмбриона является следствием сложного диалога между трофобластом и эндометрием с вовлечением многочисленных провоспалительных цитокинов, не удивительно, что многочисленные неудачные попытки ЭКО и повторяющиеся самопроизвольные аборты связаны с иммунологическими нарушениями. В списке «виновников» находятся антифосфолипидные, антитиреоидные антитела и очень большое значение имеют активированные естественные киллеры — NK (natural killer). Необходимо, однако, отметить, что относительно роли антифосфолипидных антител имеются очень противоречивые публикации. Многочисленные работы подчеркивают роль Th1-цитокинов (синтезируемых активированными NK) и цитотоксических лимфоцитов у женщин с привычным невынашиванием и неудачными попытками ЭКО.

И, наконец, обнаружена корреляция между наличием антитиреоидных антител и цитотоксичных цитокинов при повторяющихся выкидышах. Лечение с применением кортикостероидов не всегда дает желаемые результаты и не лишено нежелательных вторичных эффектов. Применение гепарина и внутривенное введение иммуноглобулинов имеет различную эффективность.

Важной проблемой остается вопрос идентификации периода максимального соответствия развития эмбриона и восприимчивости эндометрия. Фаза имплантации наиболее критическая при проведении ЭКО. Развитие эмбриона зависит от внутриматочной среды, но в то же время сигналы от эмбриона модулируют дифференциацию эндометрия. Эта синхронизация называется окном имплантации (Bergh P.A., 1992).

Еще в 1945 году P. Vigano и соавт. провозгласили такой афоризм: «Бластоциста может виртуально имплантироваться в любом месте человеческого организма, кроме нерецептивного эндометрия» (Vigano P., 2004). Перенос эмбрионов будет безуспешным, если отсутствует синхронизация между стадией развития эмбриона и эндометрия. Парадоксально, но приходится констатировать, что имплантация может наступить в любой ткани человеческого тела (при спонтанной или экспериментальной внематочной беременности) чаще всего без всякой предварительной подготовки этой ткани. В то же время эндометрий относится к числу тех редких тканей, где имплантация невозможна, за исключением окна имплантации (Delage G. et al., 1995). В этот период эндометрий максимально чувствителен к рецепции эмбриона. Предполагают, что у женщин этот период составляет 4 дня — с 20-го по 24-й день нормального менструального цикла и, следовательно, со дня сдачи лютеинизирующего гормона (ЛГ) + 7 до дня ЛГ + 11 (Acosta A.A., 2000). В последние десятилетия доказано, что это окно имплантации практически всегда зависит от координированной экспрессии химиокинов, металлопротеаз, молекул адгезии, маточной и плацентарной экспрессии факторов роста (Evain-Brion D., 1999; Merviel P., 1998), так же как и провоспалительных цитокинов, которые обеспечивают стадию аппозиции, затем адгезии, регулируют базальную инвазию плацентарного конуса, затем обеспечивают и регулируют как адгезию, так и инвазию клеток трофобласта в эндометрий (Chaouat G. et al., 1995; Chard T., 1995; Giudice L.C., 1994; Lessey B.A., 1995; Mcmaster M.T., 1992; Tabibzaden S., 1995).
Эта координированная экспрессия для некоторых медиаторов является полностью или частично гормональнозависимой от начала цикла до овуляции, когда секреция эстрогенов в дальнейшем сменяется смешанной эстрогено-прогестероновой. Под влиянием прогестерона эндометрий подвергается структурным и молекулярным модификациям, позволяющим эмбриону имплантироваться во время окна имплантации (Aplin J.D., 2000). Во время лютеиновой фазы на уровне различных структур происходит серия изменений — речь идет об эпителии желез и поверхности полости матки, клеток стромы сосудов и внеклеточного матрикса. К сожалению, оптический и даже электронный микроскоп не позволяет выявить никакой разницы в предимплантационный период у фертильных и бесплодных женщин. С 1950 года существует очень точная анатомо-морфологическая хронологическая система характеристики эндометрия, предложенная R.W. Noyes в 1975 году. Выявлено, что существует рассогласование между хронологической и гистологической датацией эндометрия. Эндометрий, исследуемый в лютеиновую фазу, может быть «в фазе» или «вне фазы». Существует расхождение более чем в 3 дня между фазой цикла и морфологическим строением. Взаимосвязь между этими морфологическими изменениями и рецептивностью эндометрия некоторыми исследователями отрицается (Barash A. et al., 1992; Castelbaum A.J. et al., 1994).

В то же время в работах других авторов доказана полезность этой датации (хронологии) и ее связь с бесплодием (ASRM, Seattle, 2002).

У животных синхронизация может быть развязана с отсрочкой на неопределенное время: например, наиболее изученная модель, с точки зрения американцев, — весенняя синхронизация и возобновление деления эмбрионов пост-бластоцисты и дифференциация матки.

У человека окно имплантации очень мало изучено по ряду причин, среди которых доминируют технические и этические факторы. В действительности никакая модель in vitro не способна восстановить сложность динамического клеточного взаимодействия, активизирующего эпителиальные, стромальные иммунокомпетентные клетки, представленные в эндометрии на протяжении окна имплантации, необходимые для процесса аппозиции-адгезии и инвазии.

Наконец, чаще всего когда мы изучаем тонкое строение эмбриона, это приводит к его деструкции, и мы не можем изучить имплантацию именно этого эмбриона. Практика биопсии эндометрия у человека в периимплантационный период нежелательна. Наконец, напомним, что существует только одна модель приматов, наиболее приближенная к человеческому виду, — шимпанзе, но этот вид имеет статус защищенного красной книгой и очень трудно получить разрешение на проведение исследований на этом животном в области репродукции, так как приоритетными являются исследования, посвященные вакцинации против ВИЧ.

Таким образом, процесс имплантации различен у разных видов, и данные исследований на животных не всегда применимы к человеку. Существуют определенные практические и этические сложности изучения процесса имплантации эмбриона человека в условиях in vivo. Поэтому данные об имплантации эмбриона человека весьма ограничены. Доступная информация основана на раздельном изучении эндометрия и бластоцисты на моделях in vitro.

Гормоны и рецептивность эндометрия. Исследование эндометриальных пиноподий
Половые стероиды абсолютно необходимы для пролиферации и децидуализации эндометрия и подготовки его к имплантации эмбриона (Gonzalez R.R. et al., 2000).

Все основные процессы роста и созревания эндометрия регулируются представителями стероидных гормонов эстрадиолом (Е2) и прогестероном (Goswamy et al., 1988; Grandolfi F., 1995).

Эти маленькие гидрофобные молекулы попадают в клетку-мишень благодаря простой диффузии. Внутри клетки медиаторами их действия являются специальные ядерные рецепторы — протеины, рецепторы эстрадиола и прогестерона. Рецепторы стероидных гормонов по своей структуре являются фосфопротеинами, а при наличии гормона происходит гиперфосфориляция рецепторов (Griesinger G., 2000).

Стероидные рецепторы непосредственно влияют на генную транскрипцию, связываясь со специфическими последовательностями ДНК. В ответ на эстрогены или прогестерон стероидные рецепторы могут связываться с эстроген- или прогестеронреагирующими (ответственными) элементами ДНК и активируют или останавливают транскрипцию (Hambarlsoumlan E., 2002).

Кроме того, стероидные молекулы могут оказывать влияние на генную экспрессию не прямо, а через промежуточные молекулы. На моделях животных было показано, что эстрадиол стимулирует транскрипцию и синтез как рецепторов эстрогена (РЭ), так и рецепторов прогестерона (РП) в матке. Прогестерон, напротив, подавляет экспрессию (Hambarlsoumlan E., 1998) эстрогенреагирующего элемента, который находится внутри кодирующей порции гена.

Уровни м-РНК не изменяются на протяжении менструального цикла в эндометрии человека, несмотря на циклические вариации количества РП (Hambarlsoumlan E., 1997; Harvey M.B., 1995).

Это свидетельствует о посттранскрипционной регуляции экспрессии РП. Оба типа рецепторов (РЭ и РП) регулируются эстрадиолом и прогестероном по клеточно-специфическому принципу. Недавно был открыт второй рецептор эстрогенов — РЭβ, в связи с чем другой, уже известный рецептор был назван РЭα. РЭα экспрессируется в основном в матке, яичниках, гипофизе, почках, надпочечниках, яичках, эпидидимусе, а РЭβ — в предстательной железе, мочевом пузыре, костях, головном мозге, яичниках (клетки гранулезы) и яичках (развивающиеся спермадиты). Существует также две изоформы РП — РПα и РПβ.

Количество эстрогеновых и прогестероновых рецепторов изменяется на протяжении менструального цикла. В ранней пролиферативной фазе РЭ и РП отсутствуют в железистом эпителии, но оба рецептора экспрессируются в стромальных клетках. Затем на протяжении регенерации и реконструкции эндометрия они появляются во всех клетках. Во время фолликулярной фазы ядерная локализация рецепторов отмечается в эпителии и строме.

Предовуляторный подъем Е 2 обеспечивает образование рецепторов к прогестерону, гормону, необходимому для гестации. Существует значительная разница между количеством рецепторов в периовуляторный и периимплантационный периоды (Hey N.A., 1994).

У пациенток с гинекологическими заболеваниями отмечается аномальная экспрессия РЭ и РП в эндометрии (Hilton D.J., 1991).

Прогестерон обеспечивает секреторную активность эндометрия, обеспечивая благоприятную среду для развития эмбриона и его имплантации. Секреторная трансформация эндометрия, вызванная прогестероном, сопровождается каскадом экспрессии генов, которые облегчают или, напротив, ограничивают имплантацию эмбриона. Яичниковые стероиды играют роль медиаторов в диалоге «эмбрион — матка» и модулируют экспрессию многочисленных факторов роста, цитокинов или молекул адгезии в материнско-плодовом пространстве. Среди этих гормонов некоторые, похоже, играют фундаментальную роль, например такие как прогестерон, Е2, а также хорионический гонадотропин человека (чХГ), ингибины, активин, релаксин, кальцитонин. Возможно, чХГ — одна из первых сложных молекул, синтезируемых эмбрионом. Он принимает участие на всех этапах диалога «эмбрион — матка». Однако ни один из этих гормонов или их рецепторов нельзя расценивать как маркер рецептивности эндометрия. Изолированное определение рецепторов к эстрогенам или прогестерону, проводимое у бесплодных женщин в момент пункции ооцитов, не позволяет абсолютно точно прогнозировать, будет имплантация или нет (Hodgen G.D., 1980).

Лептин, кодируемый геном ob, действует через гипоталамус на жировую ткань человеческого тела, играет значительную роль в процессе имплантации. Действительно, мыши ob–/– бесплодны, фертильность у них восстанавливается после инъекции рекомбинантного лептина (Ingamells S., 1996). У женщин уровень циркулирующего лептина максимальный в лютеиновую фазу (Ingamells S., 1996). Лептин и его рецепторы продуцируются эндометрием и плацентой (Jurisicova A., 1995). Этот гормон участвует в диалоге «матка — эмбрион» и модулирует инвазивные характеристики цитотрофобласта (Ka-yisll U.A., 2002).

Исследование эндометриальных пиноподий
Как показано многими исследователями, имплантация наступает только тогда, когда эндометрий, находящийся под определенным гормональным воздействием, вступает в фазу восприимчивости к имплантации бластоцисты (Kerr J.F.R., 1972; King A., 1999; Kokawa K., 2001).

Эта фаза достаточно короткая и должна совпадать с развитием эмбриона до стадии бластоцисты, определяя, таким образом, короткий интервал времени, когда возможна имплантация. Период, в течение которого эндометрий остается рецептивным для нидации эмбриона, получил название «окно имплантации». Предполагаемое окно имплантации человека теоретически совпадает с 20–22-м днем идеального 28-дневного менструального цикла (Kovach P., 2003).

Опыт работы в программе донорства яйцеклеток показал, что женщины, получающие заместительную гормональную терапию (ЗГТ) с последующим переносом эмбриона, имеют даже несколько выше шанс на успешную имплантацию, чем пациентки, проходящие стандартное ЭКО (Kupesic S., 2002; Kwak J.Y., 2000; Laird S.M., 2000; Lante-ri E., 1998), вероятно, за счет влияния гормонов и лучшей координации времени переноса эмбриона, что возможно в циклах с ЗГТ. Важно учесть, что оптимальное время для переноса эмбриона в этих циклах ограничено и не превышает 3 дней. Так, для эмбриона 2-го дня благоприятный период находится между 3-м и 5-м днем приема прогестерона (Lass A., 2001). Перенос эмбриона вне этого времени не приводит к его имплантации. Логично предположить, что это связано с ограниченностью периода восприимчивости эндометрия. Таким образом, стала ясна настоятельная необходимость открытия какого-либо маркера восприимчивости эндометрия человека к имплантации бластоцисты. Методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) поверхностного эпителия эндометрия мышей и крыс было выявлено наличие характерных выпячиваний апикальной части плазматической мембраны поверхностного эпителия в период имплантационного окна (Ledee-Bataille N., 2002; Lessey B.A., 2000; Lessey B.A., 1996).

В это время мембраны теряют свои микроворсинки и формируют гладкие выпячивания. Эти образования, как было показано на грызунах, участвуют в абсорбции маточного секрета (Lessey B.A., 1995), и поэтому они были названы «пиноподии» (от греческого pino — пить, podes — нога).

В эндометрии человека также было показано наличие аналогичных пиноподиям структур, появляющихся в середине лютеиновой фазы. Определение пиноподий было предложено как один из маркеров рецептивности эндометрия (Licht P., 2001; Lunenfeld B., 1995; Mar-tel D., 1981).

Для их изучения было проведено исследование большого количества образцов эндометрия, полученных у здоровых добровольцев — женщин, получающих стимуляцию яичников в рамках программы ЭКО, а также у женщин с искусственным циклом, получавших эстрадиол и прогестерон. Контроль стадии цикла проводился методом ультразвукового исследования и определения пика лютеинизирующего гормона в моче и сыворотке крови. Биоптаты фиксировали и подготавливали для СЭМ по описанной методике (Mcmaster M.T., 1992).

Эволюция морфологии клеток поверхностного эпителия следует определенной схеме, что дает возможность датировать биоптат секреторного эндометрия с точностью до 24–48 часов. Первые признаки формирования пиноподий представляют собой выраженное вздутие клеток, сочетающееся с исчезновением микроворсинок (МВ). Затем формируются гладкие и тонкие выпячивания мембраны, поднимающиеся со всей верхушки клетки (развивающиеся пиноподии). Вскоре после того как МВ полностью исчезают, выпячивания достигают своей максимальной величины и образуют складки или грибы (развитые пиноподии). Эта стадия длится менее 48 часов. Затем вздутие клеток уменьшается, и кончики МВ вновь появляются на поверхности мембран, которые становятся сморщенными, в то время как сама клетка начинает увеличиваться в размере (так называемый регресс пиноподий). Как выяснилось, эти изменения клеток возникают в вышеописанной последовательности во всех типах изученных циклов, а продолжительность существования развитых пиноподий обычно не превышает 2 дня. Однако конкретный день их формирования может варьировать у разных женщин. В естественных циклах развитие пиноподий наблюдается в дни пика ЛГ + 6–9 (19–22-й дни) у различных индивидов, в среднем на 20-й и 21-й дни цикла (Merviel P., 1998; Meseguer M., 2001).

В циклах стимуляции яичников в программе ЭКО развитые пиноподии формировались на 18–22-й дни цикла (получение яйцеклеток на 14-й день) у различных женщин в зависимости от особенностей протоколов стимуляции. В большинстве случаев зрелые пиноподии наблюдались уже на 19-й день, что являлось достоверной акселерацией развития примерно на 1–2 дня по сравнению с естественными циклами (Metkalf D., 1991; Murphy C.R., 2000; Murray R., 1990; Ledee-Bataille N., 2006; ASRM, Seattle, 2002; Nikas G., 1995, 1999).

В искусственных циклах день появления развитых пиноподий варьировал у женщин в промежутке до 3 дней (20–22-й дни цикла, или прогестерон 6–8) (Nikas G., 1999). В данном случае 1-й день назначения прогестерона считался днем П1. Формирование пиноподий практически не исследовалось у пациенток с аденомиозом. Примечательно, что в единственном доступном исследовании у пациенток с диагнозом «эндометриоз» (средней и тяжелой степени) не было выявлено никаких отклонений в формировании пиноподий (Nikas G., 1999). Взаимосвязь между наличием пиноподий и исходом имплантаций была исследована в 17 искусственных циклах, предваряющих перенос донорских эмбрионов (Nikas G., 1995).

В исследование были включены только случаи с эмбрионами хорошего качества. В зависимости от количества пиноподии оценивались как изобилующие, умеренные и немногочисленные в зависимости от процента занимаемой ими поверхности эндометрия (> 50, 20–50 и < 20 соответственно). У всех 5 пациенток с изобилующими пиноподиями наступила беременность, 3 из 7 женщин с умеренным числом пиноподий также забеременели, в то время как ни у одной пациентки с малым количеством или с отсутствием пиноподий беременность не наступила (Nilsson O., 1962).

Таким образом, можно подвести итоги — у женщин с нормальным менструальным циклом пиноподии появляются между 19–21-м днями менструального цикла, во время предполагаемого окна имплантации (Nilsson O., 1966). Если говорить более точно, они открывают это окно, но, похоже, не присутствуют на всем его протяжении. Их появление абсолютно зависит от наличия прогестерона, а период полужизни длится менее 48 часов с вариациями у разных пациенток в зависимости от гормонального фона (Nilsson O., 1958). Стимуляция яичников, похоже, ускоряет появление пиноподий, в то время как гормональная заместительная терапия тормозит их появление по отношению к нормальному циклу (Noda Y., 1993).

Существует корреляция между числом пиноподий и имплантаций после переноса эмбрионов. Точная роль пиноподий пока что не доказана. Появление пиноподий, похоже, связано с феноменом аппозиции бластоцисты эпителию в просвете эндометрия. И, наконец, их появление связано с появлением молекул — участниц имплантации, например интегринов, или секрецией эпидермального фактора роста, который появляется в середине лютеиновой фазы (Noyes R.W., 1975).

Необходимо отметить, что в литературе имеются несколько противоречивые сведения относительно появления и продолжительности периода существования пиноподий. Как считают R. Uzadi и соавт. (O'Malley B.W., 1992), несмотря на то что пиноподии, очевидно, представляют собой определенную модификацию поверхности эндометрия, важную для имплантации, время их формирования на клетках поверхностного эпителия отчетливо выходит за пределы предполагаемого окна имплантации. A. Acosta и соавт. в своем обширном исследовании также показали несколько отличающиеся результаты: истинные пиноподии появляются небольшими группами с 20-го дня цикла и остаются до конца секреторной фазы (Oenler M.K., 2000).

Эти разногласия можно объяснить следующим образом. В позднюю секреторную фазу клетки поверхностного эпителия эндометрия подготавливаются к отторжению во время менструации. Это проявляется в виде увеличения (набухания) клеток и может быть ошибочно принято за «долгоживущие пиноподии» (Olivennes F., 2002). Эти клетки неодинаковы по размерам и кажутся потрескавшимися или сморщенными в результате апоптоза и некротических изменений, в чем заключается их отличие от истинных пиноподий. В исследованиях других авторов всегда наблюдалось отсутствие истинных пиноподий уже после пика ЛГ + 10 дней (Ortiz M.E., 1986; Parker M.G., 1998), что согласуется с другими данными (Paulson R.I., 1990; Plachot M., 2000; Polgar K., 2002; Psychoyos A., 1971, 1973, 1994; Quinton R.R., 1999; Racowsky C., 2002; Remoni J., 1993; Ren S.G., 1997; Sargent I.L., 1998; Sharpe-Timms K.L., 2001; Shervin J.R., 2002; Simon C., 2001; Somkuti S.G., 1997).

В настоящее время единственным достоверным методом изучения пиноподий является электронная микроскопия. Пиноподии могут быть визуализированы также под световым микроскопом как выпуклые апикальные выпячивания клеток (Aghajanova L., 203; Develioglu O.H., 2000), однако лимитирующими факторами являются низкое разрешение световой микроскопии и невозможность исследования больших участков тканевого среза.

Неясной остается роль пиноподий в процессе имплантации. В отличие от грызунов в эндометрии человека пиноподии не участвуют в абсорбции жидкости из полости матки (Adams S.M., 2002). Исходя именно из этого факта, C. Murphy предложил именовать плазматические выпячивания не пиноподиями, а ютеродомами (uterodomes), что, по его мнению, наиболее четко отражает происхождение и не затрагивает описание функциональных качеств клеточных образований (Murphy C.R., 2000).

Тем не менее связь пиноподий (сегодня это название является общепринятым) с факторами роста и другими биологически активными веществами предполагает их возможное непосредственное участие в механизме имплантации. Со своей апикальной поверхности они, например, могут стимулировать клеточную пролиферацию и инвазию эмбриона и способствовать децидуализации эндометрия.

Вариабельность появления пиноподий от одного цикла к другому, необходимость биопсии во время окна имплантации, а также необходимость электронной микроскопии ограничивают широкое клиническое применение этого маркера. Дальнейшее исследование факторов имплантации позволяет углубить понимание процесса имплантации и идентифицировать маркеры периода имплантационного окна. В идеале они должны определяться неинвазивным методом, что позволило бы проводить перенос эмбриона в том же цикле. Сегодня клиническое исследование эндометрия на наличие пиноподий является эффективным, но инвазивным методом оценки эндометриального статуса. Обычно оно производится в естественном цикле после нескольких неудачных циклов ЭКО. Проводить перенос в этом же цикле не представляется возможным, а состояние эндометрия в стимулированном цикле все же несколько отличается от такового в естественном цикле.

Коэкспрессия пиноподий с другими маркерами восприимчивости эндометрия
1. Коэкспрессия пиноподий и стероидных рецепторов.

Формирование пиноподий в эндометрии человека в предымплантационный период и одновременную выработку некоторых биологически активных веществ изучали в биоптатах, полученных у одних и тех же женщин.

Были досконально изучены стероидные рецепторы эндометрия. Так, определено, что в середине секреторной фазы происходит уменьшение числа рецепторов прогестерона (Oenler M.K., 2000).

Появление же зрелых пиноподий совпадает с резким снижением степени иммуноокрашивания на рецепторы прогестерона в эпителии и с образованием плато концентрации прогестерона в крови. Раннее формирование пиноподий в стимулированных циклах сопровождалось ранним снижением уровня рецепторов прогестерона и четко соотносилось с преовуляторным повышением уровня прогестерона выше 6 нг к 13-му дню (Develioglu O.N., 1999; Stavreus-Evers A., 2001).

2. Коэкспрессия пиноподий и фактора, ингибирующего лейкемию.

Очень важным звеном имплантации эмбриона является фактор, ингибирующий лейкемию (ФИЛ). Интересные данные были получены при изучении ультраструктуры поверхностного эпителия человеческого эндометрия и экспрессии фактора, ингибирующего лейкемию (leukemia inhibitory factor), в одном и том же образце ткани (Aghajanova L., 2003).

Была выявлена корреляция экспрессии ФИЛ и его рецептора и присутствия пиноподий на поверхности человеческого эндометрия (Aghajanova L., 2003).

Причем максимальная экспрессия цитокина и рецептора совпадала со стадией расцвета пиноподий, что соответствовало предполагаемому периоду имплантации бластоцисты. Можно предположить, что ФИЛ выделяется в виде своей трансмембранной формы в полость матки, где он взаимодействует с поверхностью бластоцисты.

Роль фактора, ингибирующего лейкемию, в репродукции человека
В последнее время внимание многих ученых привлечено к изучению роли цитокинов в системе репродукции человека. Цитокины — это биологически активные вещества, полипептиды, играющие важную роль в функции клетки и в передаче сигналов. Фактор, ингибирующий лейкемию — один из наиболее интересных с точки зрения репродуктивной функции животных и человека цитокинов.

ФИЛ , или leukemia inhibitory factor (LIF), впервые был идентифицирован в 1986 г . Metkalf и коллегами в Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australia (Metkalf D., 1991).

ФИЛ представляет собой высокогликолизированный полипептид с молекулярной массой 20 000, который кодируется геном, локализованным у человека в хромосоме 22q12. Ген ФИЛ не проявляет гомологичности ни с одним из известных факторов роста или цитокинов.

ФИЛ в норме продуцируется различными видами клеток, включая фибробласты, клетки гемопоэтического ряда, гепатоциты, эндотелиальные клетки, сенсорные и автономные нервные клетки, остеобласты, астроциты некоторые необластические клетки (Metkalf D., 1991). Эффекты ФИЛ в различ- ных физиологических системах включают пролиферацию, дифференциацию клетки (Hilton D.J., 1991). Потенциальными индукторами синтеза ФИЛ являются интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухоли (TNF), эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF) (Auernhammer P., 2000).

Механизм действия ФИЛ включает активацию двух компонентов: ФИЛ-специфического рецептора и мембранного рецептора гликопротеина gp130. Связывание с высокоспецифическим ФИЛ-рецептором не конкурируется ни с одним из известных факторов роста или цитокинов, чем обусловлены многие уникальные функции ФИЛ. В то же время gp130 служит рецептором также для родственных цитокинов IL-6, IL-11, онкостатина М, CNTF и CT-1, чем объясняется частичное дублирование многих эффектов ФИЛ указанными цитокинами (Амбарцумян Э.М., 2004).

Было обнаружено, что ФИЛ in vitro поддерживает эмбриональные стволовые клетки в недифференцированном состоянии, ингибируя их дифференциацию, но не влияя на пролиферацию клеток (Амбарцумян Э.М., 2004).

Таким образом, выяснилось, что ФИЛ является первым протеином, способным влиять на фенотип эмбриональных клеток. Было выявлено, что ФИЛ и РНК продуцируются бластоцистой (Murray R., 1990), а также в желточном мешке эмбрионов.

Прямые доказательства того, что ФИЛ является фактором, абсолютно необходимым для процесса имплантации у мышей, были получены в экспериментах с использованием генной инженерии. Было обнаружено, что у самок мышей с инактивированным ФИЛ-геном процесс фертилизации яйцеклеток не нарушен, однако последние оказались не способны к имплантации (Stewart C.L., 1992). При пересадке бластоцист от указанных самок в матку интактным самкам имплантация происходила нормально, свидетельствуя о значении ФИЛ материнского происхождения для успешного внедрения эмбриона в матку. Искусственное введение мышам с дефицитом ФИЛ-гена рекомбинантного цитокина восстанавливало процесс имплантации.

ФИЛ присутствует практически во всех клеточных структурах и тканях репродуктивной системы человека, включая яичники, маточные трубы, матку, плаценту. Функцию цитокина можно проследить на самых различных этапах репродуктивных процессов, начиная с роста и развития гамет и заканчивая наступлением и прогрессированием беременности.

Клетки мозгового и коркового слоев яичника продуцируют ФИЛ и РНК (Arici A., 1997), подтверждая вероятную роль этого цитокина в развитии яйцеклетки и физиологии овуляции. Действительно, присутствие ФИЛ было выявлено в фолликулярной жидкости человека (Arici A., 1997), где его уровень значительно повышался к моменту предполагаемой овуляции. В маточных трубах высокий уровень ФИЛ определялся в ампулярном отделе, предполагая роль ФИЛ на самой ранней стадии эмбрионального развития. Данные о роли ФИЛ в эмбриогенезе человека противоречивы. Так, результаты исследований I. Sargent и соавт. (Sargent I.L., 1998) показали, что ФИЛ in vitro способен усилить частоту образования бластоцист эмбриона человека с 18,4 % в контроле до 43,6 %. Тем не менее эти данные не были подтверждены другими исследователями (Jurisicova A., 1995).

Наиболее интригующими оказались результаты исследования функции ФИЛ в эндометрии человека, где этот цитокин продуцируется в течение всего менструального цикла (Амбарцумян Э.М., 2004).

Было выявлено, что уровень ФИЛ низкий в пролиферативную фазу, повышается после овуляции и остается относительно высоким почти до конца менструального цикла, снижаясь с началом менструации до базального уровня. Эти данные явились первыми указаниями на вероятную роль цитокина в имплантации у человека.

При иммуногистохимическом окрашивании выявлено, что ФИЛ вырабатывается в железистом и поверхностном эпителии эндометрия, а также, но в меньшей степени, в строме (Амбарцумян Э.М., 2004). В то же время экспрессия ФИЛ-специфических рецепторов ограничена поверхностным и железистым эпителием. Эти данные предполагают, что протеин ФИЛ может оказывать прямое воздействие аутопаракринным механизмом на эпителий эндометрия (но не на строму) и таким образом модулировать уровень рецептивности матки. Группой исследователей изучена взаимосвязь между экспрессией ФИЛ, его рецепторов и таким морфологическим маркером восприимчивости матки к имплантации бластоцисты, как эндометриальные пиноподии (Aghajanova L., 2003).

Результаты этих исследований показали, что в эндометрии в стадии секреции у здоровых женщин репродуктивного возраста максимальное иммуноокрашивание препаратов при использовании антител к ФИЛ и ФИЛ-рецептору совпадает по времени с развитием пиноподий. Эти данные свидетельствуют о строгой прямой корреляции между основными эндометриальными маркерами имплантации, подтверждая тем самым роль цитокина в имплантации у человека. Важно отметить, что в этот период сам эмбрион человека играет активную роль, продуцируя на своей поверхности ФИЛ-специфические рецепторы (Амбарцумян Э., 1999). Процесс взаимодействия эмбриона с материнским организмом имеет двусторонний характер: эмбрион способен активно продуцировать ФИЛ и РНК, в то время как в эндометрии уровень ФИЛ-рецепторов gp130 и функциональная активность ФИЛ-рецепторов также возрастают. Установлено, что как только эмбрион погружается в эпителий и доходит до стромы, он начинает синтезировать ряд цитокинов, IL-1; TNF и TGF-бета, индуцируя тем самым дальнейшую секрецию ФИЛ стромальными клетками. Активация рецепторов IL-1 и TNF соответствующими цитокинами приводит к фосфорилированию транскрипционного фактора Nuclear factor B (NF с последующей его транслокацией в клеточное ядро. В клеточном ядре указанный фактор связывается с соответствующим регионом ФИЛ-гена, индуцируя таким образом его синтез в эндометрии.

В сложных взаимоотношениях между эмбрионом и материнским организмом ФИЛ играет важную роль как медиатора, так и стимулятора. ФИЛ, вырабатываемый в децидуальной ткани, способен регулировать функцию трофобласта и способствовать его инвазии в маточную ткань. Децидуальная ткань способна вырабатывать ФИЛ, хотя и в меньшей степени, чем секреторный эндометрий. Продукция цитокина в децидуальной ткани находится под гормональным контролем материнского организма (Zaidi J. et al., 1995). ФИЛ децидуального происхождения способен модулировать уровень хорионического гормона, стимулируя или угнетая его продукцию в трофобласте в зависимости от продолжительности, дозы или времени его воздействия (Ren S.G., 1997).

Один из специфических механизмов регуляции функции фетотрофобласта цитокином может быть связан с его действием на оксид азота. Оксид азота является мощным миорелаксантом и вазодилататором, а также играет роль барьера по отношению к инфекционным агентам.

Одним из наиболее интересных аспектов ФИЛ можно считать его возможное участие в процессах трансформации трофобласта в различные его формы: в инвазивный цитотрофобласт или высокодифференцированный синцитиотрофобласт. Ряд исследований продемонстрировал, что ФИЛ способен индуцировать продукцию протеиназ клетками трофобласта (Harvey M.B., 1995), принимая таким образом участие в регуляции инвазии трофобласта. ФИЛ также стимулирует выработку в трофобласте фибронектина (Nachtigall M.J., 1996), специфического гликопротеина, ответственного за связывание трофобласта с экстрацеллюлярным матриксом эндометрия, таким образом, направляя развитие части трофобластических клеток в сторону адгезивного фенотипа. ФИЛ также способен активировать в человеческой плаценте фосфопротеин, стимулирующий вазодилатацию, который играет особую роль в миграции клеток (Kayisll U.A., 2002).

Роль ФИЛ в бесплодии человека
В числе первых клинических работ, посвященных роли ФИЛ в женской репродукции, были работы G. Delage и соавт. (1995) и S. Laird (2000). Эти исследователи показали присутствие ФИЛ в эндометрии человека, а также в промывных водах матки в период ожидаемой имплантации, причем количество цитокина было достоверно снижено у женщин, страдающих бесплодием. В дальнейшем более детальная попытка изучения роли ФИЛ в процессах имплантации у человека была проведена Амбарцумян и соавт. (2002). Авторы исследовали продукцию ФИЛ в эндометрии женщин, страдающих бесплодием неясного генеза, у которых имелась специфическая проблема нарушения имплантации. Она предполагалась у здоровых по всем остальным параметрам женщин, у которых в анамнезе имелось 5 и более безуспешных попыток экстракорпорального оплодотворения с общим количеством перенесенных эмбрионов более 10. В указанной популяции женщин в 73 % случаев наблюдается дисфункция продукции эндометриального ФИЛ. Так, секреция протеина ФИЛ у таких женщин характеризовалась высоким уровнем по сравнению с контрольным и выраженной вариабельностью в пролиферативную фазу цикла. В то же время в секреторную фазу цикла продукция цитокина характеризовалась отсутствием динамического возрастания. В результате в дни предполагаемой имплантации уровень продукции ФИЛ у бесплодных женщин с нарушением имплантации был в 3,5 раза ниже, чем у фертильных. Интересно, что в этой популяции женщин в период имплантации также значительно снижена эндометриальная секреция рецептора gp130 (Shervin J.R., 2002). Аналогично продукция эндометриального ФИЛ нарушена у женщин, страдающих многократными выкидышами (Attar E., 1998). Теоретически предполагается, что высокая концентрация ФИЛ вокруг поверхностного и железистого эпителия инициирует имплантацию (Cheng J.G., 2001). Эксперименты на животных показали, что маточная рецептивность в момент имплантации характеризуется повышенной секрецией ФИЛ в железистом эпителии и последующим связыванием его с ФИЛ-рецепторами в поверхностном эпителии (Cheng J.G., 2001).

Этот процесс имеет как прямое следствие фосфорилизацию и нуклеарную транслокацию таких транскрипционных факторов, как STAT3 (signal transducer and activator of тranscription). In vitro эксперименты показали, что локализация активированного ФИЛ STAT3 в поверхностном эпителии по времени совпадает с максимальной рецептивностью матки (Cheng J.G., 2001). Эти работы позволили прояснить некоторые механизмы функции ФИЛ как медиатора имплантации. Однако данных, свидетельствующих о механизмах действия ФИЛ в процессах имплантации человека, явно недостаточно. Одно исследование недавно было посвящено изучению генетического статуса женщин, страдающих бесплодием. В популяции этих женщин были описаны частичные мутации гена, кодирующего ФИЛ, что указывало, таким образом, на генетический аспект проблемы бесплодия и связанных с ним нарушений продукции эндометриального ФИЛ (Судома И.А. и др., 2004).

Результаты приведенных выше исследований о сниженной продукции эндометриального ФИЛ у женщин с бесплодием неясного генеза позволяют предположить возможность применения цитокина с лечебной целью в качестве заместительной терапии (Lass A., 2001). В этом плане перспективными представляются исследования, посвященные возможности локального применения цитокина. Так, результаты оригинальных экспериментов Y. Hsieh и соавт. показали (Hsieh Y.Y., 2002), что при использовании плазмидов — носителей гена ФИЛ этот цитокин может быть успешно транспортирован через липосомы в структуру эндометрия мышей, который в дальнейшем приобретает способность продуцировать ФИЛ. Было высказано предположение об аналогичной возможности in vivo транспортировки гена ФИЛ в эндометрий человека как о методе вероятной заместительной терапии. Кроме того, введение микродоз хорионического гонадотропина в полость матки в предымплантационный период стимулирует продукцию цитокина (Licht P., 2001). Как показали результаты исследований (Амбарцу-
мян Э., 1997), имеется выраженная отрицательная корреляция между концентрацией ФИЛ в эндометрии в фазе пролиферации с развитием и эхоскопической характеристикой его ткани. Эти данные свидетельствуют о роли цитокина в физиологическом развитии эндометрия. Обнаружено также, что уровень ФИЛ значительно выше в секреторную фазу цикла, чем в пролиферативную (Arici A., 1997). С другой стороны, человеческие эмбрионы преимплантационной стадии (бластоцисты) имеют на своей поверхности специфические ФИЛ-рецепторы, что свидетельствует о возможном механизме взаимодействия эмбриона и материнских тканей. Обнаружено, что у женщин с бесплодием уровень ФИЛ снижен (Chen D.B., 1995), что еще раз указывает на возможную важную роль цитокина в процессе имплантации у человека.

Ряд исследований посвящен изучению диагностических возможностей определения уровня ФИЛ. Так, в работе N. Ledee-Bataille (2002) показано, что определение уровня ФИЛ в эндометриальных смывах женщин может иметь прогностическое значение для наступления последующей беременности. У женщин, у которых на 26-й день менструального цикла выявлена дисфункция в продукции цитокина, последующий цикл ЭКО оказывался безуспешным. Интересно отметить, что в других работах, проведенных той же группой исследователей (Olivennes F., 2002), уровень ФИЛ в маточных смывах в день забора яйцеклетки не отражался на исходе процедуры ЭКО. Э.М. Амбарцумян и соавт. доказали, что уровень ФИЛ в цервикальной слизи также строго коррелирует с ростом и рецептивностью эндометрия, свидетельствуя о том, что определение уровня ФИЛ в цервикальной слизи может служить новым неинвазивным тестом для диагностики готовности матки к последующей беременности. В целом работы в этом направлении еще только начинаются и дальнейшие исследования представляют значительный интерес.

Таким образом, анализ современной литературы свидетельствует о неоспоримой роли ФИЛ в репродукции человека. ФИЛ активно синтезируется органами репродукции человека и принимает важное участие в физиологических изменениях эндометрия. Ряд прямых и косвенных данных свидетельствуют о специфической функции цитокина в процессах имплантации, а именно в создании благоприятного микроклимата в репродуктивных органах, и его посреднической роли между эмбрионом и материнским организмом. ФИЛ также принимает активное участие в функции плаценты, регулируя процессы роста, дифференцировки и функциональной активности трофобласта.

Дальнейшее изучение механизма действия этого цитокина будет способствовать лучшему пониманию патофизиологических процессов, регулирующих репродуктивную функцию человека, гарантируя новые лечебные и диагностические подходы.

Следующей группой молекул, играющих важную роль в непосредственном процессе имплантации, являются интегрины, а также гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста. Интегрины принадлежат к семейству клеточных адгезивных молекул, которые присутствуют практически во всех клетках и принимают участие в клеточно-клеточных и клеточно-матричных реакциях распознавания (Sharpe-Timms K.L., 2001). Интегрины — это гликопротеиды клеточной поверхности, которые состоят из двух субъединиц α и β. Эти субъединицы используются как рецепторы для экстрацеллюлярного матрикса. Большое количество интегринов постоянно экспрессируется в эндометрии на протяжении менструального цикла. В эпителиальных клетках α2β1, α3β1, α6β4 присутствуют во всех фазах цикла (Lessey B.A., 2000).

В поверхностном эпителии α6β4 увеличиваются во время имплантации, а в железах резко уменьшаются (Lantery E., 1998).

В стромальных клетках классический рецептор фибронектина α5β 1290 экспрессируется постоянно, а в эпителиальных в норме не выявляется (Lessey B.A., 2000).

Важную роль в процессе роста и дифференцировки эндометрия и взаимодействия эндометрия и бластоцисты играет апоптоз (Tilly J.L., 2002).

Апоптоз — это универсальный физиологический процесс, который отвечает за поддержание гомеостаза в многоклеточных организмах. Термин «апоптоз» (от греческого apo и ptosis — убежать от чего-либо) впервые предложен J. Kerr, A. Wyllie, A. Currie в 1972 году для описания физиологической смерти клетки. В работе J.F.R. Kerr и соавт. описаны основные этапы апоптоза:

— отделение клеток от других и/или от экстрацеллюлярного матрикса;

— потеря цитоплазматического объема;

— конденсация хроматина и краевое расположение вдоль ядерного конверта;

— фрагментация цитоплазмы клетки в связанные с мембраной везикулы, которые называются апоптотическими тельцами.

Конечная судьба этих клеток — фагоцитоз клеточных фрагментов макрофагами или окружающими эпителиальными клетками. Апоптотическая клетка представляет также некоторые биохимические изменения. Наиболее известные из них — фрагментация ядерного хроматина в моно- и олигонуклеосомальные единицы (180–200 bp). Во время апоптоза происходит смерть клетки без выделения ею протеолитических ферментов и других клеточных составных частей, уменьшая вероятность возникновения воспалительного процесса. В регуляции менструального цикла функция апоптоза состоит в элиминации функционального слоя эндометрия во время поздней лютеиновой и менструальной фаз. Это сопровождается пролиферацией новых клеток из базального слоя во время пролиферативной фазы последующего менструального цикла. По данным некоторых авторов (Koka-wa K., 2001), апоптотические клетки распределены приблизительно одинаково в железах и в строме. Другие исследователи (Dahmoun M., 1999) полагают, что большинство апоптотических клеток эпителиального происхождения и значительное меньшинство — стромального. Возможно, апоптоз является динамическим процессом, который начинается в базальных железах и распространяется через функциональный слой в строму (Von Rango H., 1998).

В 2000 году T.E. Vaskivuo и соавт. исследовали связь апоптоза с гормональной регуляцией (Vaskivuo T.E., 2000).

В процессе исследования оказалось, что эндометриальный апоптоз негативно коррелирует с концентрацией эстрадиола в сыворотке крови, а самое достоверное увеличение интенсивности апоптоза наблюдается при падении концентрации эстрадиола и прогестерона в поздней лютеиновой фазе. Падение концентраций этих гормонов вызывает вазоконстрикцию спиральных артериол, что также приводит к ишемии и некрозу эндометрия. Таким образом, в процессе отторжения эндометрия задействованы оба механизма — некроз и апоптоз, интенсивность которого остается высокой в фазе десквамации. Вероятнее всего, главная функция апоптоза в эндометрии, пик которого наступает в ранней стадии пролиферации, состоит в завершении процесса элиминации остатков эндометрия, в «дообработке» старых клеток. У пациенток с гинекологической патологией эти функции нарушены (Dmow ski W.P., 2001). Основываясь на этих исследованиях, можно считать, что снижение и разурегулированность апоптоза в эндометрии больных с эндометриозом и аденомиозом, может быть, является одним из главных механизмов возникновения и прогрессирования самого заболевания, а также причиной диспластических и гиперпластических процессов эндометрия.

Эмбрион является активным участником процесса имплантации. Наличие бластоцисты в стадии позиционирования предохраняет эндометрий от апо-птоза. В работе A. Galan (2000) показано, что даже эмбрионы, не достигшие стадии бластоцисты, снижают количество апоптотических клеток в культуре эндометриальных эпителиальных клеток. Однако далее, на стадии адгезии, бластоциста индуцирует паракринную апоптотическую реакцию. Вероятнее всего, система запуска апоптоза Fas/Fas-L задействована в преодолении барьера для имплантации бластоцисты (Galan A., 2000).

Наряду с вышеизложенными механизмами в имплантации эмбриона задействованы иммунологические процессы. В 1953 году Питер Брайн Медавар впервые выдвинул гипотезу, согласно которой плод рассматривается как наполовину чужеродный аллогенный трансплантат. В последующем были проведены многочисленные научные исследования в области иммунологии репродукции, однако удалось выяснить лишь некоторые механизмы иммунологической толерантности материнского организма к плоду.

Механизмами, обеспечивающими процесс выживания эмбриона и плода, являются:

— селективная экспрессия антигенов, являющихся критическими по аллореактивности;

— наличие некоторых цитокинов в маточно-плодовом пространстве;

— локальная продукция специфических иммуносупрессивных агентов (Шмагель К.В., 2003).

Взаимодействие между матерью и эмбрионом развивается в двух несколько различных направлениях. С одной стороны, фетоплацентарные ткани нуждаются в надежной антиинфекционной защите, с другой стороны — необходима толерантность к плацентарным аллоантигенам. На стадии имплантации и ранних стадиях эмбриогенеза толерантность обеспечивается преимущественно неспецифическими механизмами, такими как гормональная иммуносупрессия (хорионический гонадотропин, прогестерон), некоторыми специфическими антигенными свойствами трофобласта (Vassiliaou N., 1999).

Одним из первых изменений в периферическом иммунном ответе является увеличение количества лейкоцитов (Nieuwenhoven A.L., 2003).

Наиболее изученным являются изменения в состоянии Т-лимфоцитов. В популяции Т-лимфоцитов выделяют Т-хелперы (Тх) и Т-цитотоксины/супрессоры (Тс). Тх помогают другим иммунным клеткам, продуцируя цитокины, а Тс могут непосредственно элиминировать чужеродные и инфицированные клетки. Количество Тх и Тс может либо изменяться, либо не изменяться на протяжении беременности. Тх по типу цитокинов, которые они продуцируют, разделяют на 2 типа: первый (Тх-1) и второй (Тх-2). Тх-1 — провоспалительные цитокины продуцируют гамма-интерферон, IL-2, фактор некроза опухоли, которые стимулируют клеточные реакции. Тх-2 — противовоспалительные цитокины продуцируют IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, которые принимают участие в гуморальном иммунном ответе.

В 1993 году T.G. Wegmann и соавт. впервые предложили концепцию беременности как Тх-2 феномена (Weg-mann T.G., 1993). Переключение продукции цитокинов с типа Тх-1 на Тх-2 происходит под влиянием прогестерона через индукцию прогестерониндуцированного блокирующего фактора в лимфоцитах (Check J.H., 1997).

Другим механизмом влияния может быть «вмешательство» трофобласта в продукцию цитокинов. Так, было показано, что in vitro плацентарные и трофобластические клетки продуцируют факторы, тормозящие цитотоксическую активность Т-лимфоцитов (Agarwal R., 2000). Более того, трофобластические клетки продуцируют цитокины преимущественно 2-го типа, что также определяет материнский ответ.

Таким образом, успешность беременности поддерживается в основном типом реакции Тх-2 (Chaouat G., 1999). Цитокины 1-го типа могут прямо или опосредованно разрушать эмбрион путем активации цитотоксичности. Так, TNF-α может вызвать некроз имплантированного эмбриона, гамма-интерферон ингибирует секрецию CSF-1, который способствует росту и дифференцировке бластоцисты. Среди цитокинов типа Тх-2, наверное, наиболее важным является IL-10. Этот цитокин продуцируется в большом количестве в децидуальном слое на материнско-фетальной границе. Инъекции IL-10 клону мышей, склонных к самопроизвольным абортам, обеспечивали сохранение беременности, и, наоборот, введение им анти-IL-10-антител увеличивало количество самопроизвольных абортов (Griesinger G., 2000).

Несмотря на большое значение натуральных киллеров в механизмах сохранения беременности, в литературе опубликовано очень мало данных относительно периферических NK у беременных (Nieuwenhoven A.L., 2002). Количество NK, а также продукция ими гамма-интерферона значительно уменьшается у беременных в сравнении с небеременными. Эти изменения количества и активности NK также связаны с переключением от клеточного к гуморальному типу иммунного ответа.

У беременных NK являются эмбриотоксическими. Так, A. Beer и соавт. (1996) показали, что если у женщин, проходящих лечение методом ЭКО, процентное соотношение превышало 18 %, рождение живых детей не наблюдалось. Более того, у пациенток с самопроизвольными абортами Т-лимфоциты и NK-клетки проявляли эмбриотоксичность in vitro (Bulmer J.N., 1991).

Во время инвазии эмбриона трофобласт тесно контактирует с различными материнскими клетками, такими как железистые, стромальные, эндотелиальные клетки, и особенно материнские лейкоциты. Лейкоциты составляют около 10 % клеток стромы в фазе пролиферации, 20 % — в середине секреторной фазы (предымплантационный период) и возрастают до 30 % при наступлении беременности (Bulmer J.N., 1991).

Популяция лейкоцитов состоит из Т-клеток, макрофагов и больших гранулезных лейкоцитов — LGL (large granulated lymphocytes). Часть Т-клеток составляет 45 % в фазе пролиферации и уменьшается в секреторной фазе, абсолютное их количество остается неизменным на протяжении менструального цикла (Bulmer J.N., 1996). Количество макрофагов также остается постоянным, увеличиваясь только в стадии десквамации.

LGL, или эндометриальные NK, функционально и фенотипически принадлежат к естественным киллерам, но в отличие от NK периферической крови они экспрессируют CD56, но не экспрессируют CD16 и CD57. Они редко встречаются в эндометрии в фазу пролиферации, однако в лютеиновую фазу и в фазу ранней гестации их количество быстро возрастает и составляет более 80 % всех лейкоцитов (Судома И.А., 2004).

NK образуются в костном мозге. После дифференцировки они попадают в периферическую циркуляцию на очень ранней стадии созревания. Их физиологическая роль заключается в контроле интенсивности инвазии трофобласта и предупреждении возникновения локальной инфекции. Материнские Т-клетки теоретически не могут ни распознать, ни уничтожить фетальные клетки, которые не имеют антигенов классических молекул МНС (major histocompatibility complex — главного комплекса гистосовместимости) класса 1 и 2. Децидуальные Т-клетки также не могут in vitro разрушить клетки трофобласта первого триместра, но если на протяжении короткого времени их выдержать с IL-2, они активируются и могут специфически распознавать и убивать клетки, которые не имеют или имеют недостаточное количество антигенов класса МНС (King A., 1999). Возникает вопрос, каким образом фетальные клетки избегают разрушения LGL in vivo, ведь в эндометрии определяется большое количество IL-2. Пять независимых групп экспертов пришли к выводу, что защиту от цитолиза, обусловленного LGL, выполняют молекулы HLA-G и HLA-1b (Сківка Л.М., 2004). Были обнаружены рецепторы на LGL, которые могут посылать тормозящие сигналы после взаимодействия с HLA-G и, вероятно, HLA-1b-антигенами. Однако, несмотря на наличие таких тормозящих сигналов, в работах ряда авторов было доказано, что повышенное количество периферических NK в крови и повышенная инфильтрация эндометрия NK вызывает перенапряжение и срыв механизмов блокировки, что приводит к нарушению имплантации в программах ЭКО и таким осложнениям беременности, как преэклампсия и самоаборты (Kwak J.Y., 2000). Другой важный механизм защиты эмбриона связан с тем, что во время имплантации запускаются провоспалительные процессы, местные лейкоциты активируются, под влиянием хемокинов появляется большое количество фагоцитирующих клеток. Львиную долю этих клеток составляют полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилы и эозинофилы), которые обладают очень коротким периодом жизни и погибают в течение 1–3 дней. Исследования на животных моделях показали, что эта фаза беременности характеризуется действием провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, интерлейкин-1, гамма-интерферон. Через несколько дней заканчивается провоспалительная фаза беременности, под действием прогестерона и инвазии бластоцисты происходит сдвиг баланса цитокинов с Tx-1 к Tx-2-типу (Сківка Л.М., 2004).

Окно имплантации и окно переноса
Необходимо различать окно имплантации и окно переноса (Navot D., 1991).

Действительно, большинство программ ЭКО предполагают перенос эмбрионов в полость матки на стадии 4–8 клеток (2–3-й день после оплодотворения). Этот промежуток времени называется окном переноса и предшествует окну имплантации на 2–4 дня.

В настоящее время большинство репродуктологов стремится пролонгировать культивирование эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты (Blake D., 2002; Wilson M., 2002; Racowsky C., 2002; Plachot M., 2000).

Основная цель пролонгированного культивирования — синхронизировать окно переноса и окно имплантации, убедиться in vitro, что произошла активация генома эмбриона (стадия 8 клеток) и что предымплантационное развитие эмбриона удовлетворительное. Все это должно увеличить процент имплантаций. Противники пролонгированного культивирования приводят аргументы о необходимости перенести эмбрион как можно быстрее в его физиологическую среду, так как условия in vitro не абсолютно идентичны условиям in vivo. И, кроме того, созревания эндометрия при стимуляции яичников ускорено. И, наконец, результаты пролонгированного культивирования значительно варьируют от одной команды к другой.

Описание процесса имплантации

Имплантация состоит из двух феноменов: аппозиция-адгезия, общая для всех млекопитающих, и инвазия, которую находят у rongeurs и приматов (следовательно, у человека). В этих двух группах начало имплантации имеет фиксированную точку отсчета, после «вылупливания» бластоцисты из блестящей оболочки или же после хетчинга. Адгезия трофобластического эпителия и эндометрия — настоящий биологический парадокс. На уровне места имплантации эти два эпителия разного генетического происхождения (эпителий бластоцисты с одной стороны и неадгезивная поверхность апикальной части клеток эпителия с другой стороны) сливаются. Доказано раннее влияние фетального онкофибронектина, выявляемого на наружной поверхности клеток трофобласта, и интегринов, расположенных по краю апикально-латеральных клеток эпителия матки. На участке концептуса, где происходит первый контакт между трофобластом и эпителием просвета, в дальнейшем формируются ворсины хориона с последующим формированием плаценты.

Адгезия бластоцисты к эпителию просвета

Неадгезивная природа эпителия матки обусловлена наличием слоя гликокаликса, покрывающего поверхность клеток эпителия. Гликокаликс — разновидность муцина MUC-1 — экспрессирован на поверхности клеток эпителия человека и мышей. У человека его экспрессия максимальна в период имплантации, в то же время у мышей она минимальна в этот момент. У женщин экспрессия MUC-1 на уровне эпителия матки прогестеронозависима и возрастает к концу фазы пролиферации, чтобы стать максимальной во время окна имплантации (Hey N.A., 1994).

В последних работах с использованием клеточной культуры in vitro при культивировании клеток эпителия и человеческого эмбриона доказано, что во время фазы аппозиции наличие эмбриона увеличивает экспрессию MUC-1 на уровне клеток эпителия. Но после адгезии бластоцисты к клеткам эпителия наступает паракринное ингибирование синтеза MUC-1 в месте имплантации. Можно сделать вывод, что MUC-1 — антиадгезивная молекула, которая, вероятнее всего, локально при наличии бластоцисты становится участником фазы адгезии (Meseguer M., 2001).

Инвазия трофобласта

В зависимости от степени проникновения трофобласта в эндометрий различают гистологический тип плаценты. У человека и позвоночных эта пенетрация максимальна с эрозированием сосудистого эндотелия. Следовательно, речь идет о гемохориальном типе плацентации. У приматов инвазия происходит путем интрузии: синцитиотрофобласт проникает между клетками эпителия матки, прежде чем их фагоцитировать. Связывание клеток трофобласта с составляющими базальной мембраны и внеклеточного матрикса осуществляется посредством интегринов. Распространение трофобласта в строму матки сопровождается лизисом базальной мембраны путем активации протеаз и металлопротеаз. Этот процесс строго контролируется и ограничивается местом имплантации (в отличие от опухолевого процесса) благодаря равновесию между секрецией металлопротеаз и их специфических ингибиторов — тканевых ингибиторов металлопротеаз под влиянием цитокинов и факторов роста (фактор некроза опухоли, ФИЛ, эпидермальный фактор роста).

Перенос эмбрионов
Наряду с проблемами рецептивности эндометрия техника переноса при хорошем качестве эмбрионов, как нам кажется, является определяющим моментом. Лучше выполнять его под контролем УЗИ, чтобы избежать травматизации эндометрия и кровянистых выделений. Сокращения матки и дискомфорт после переноса также являются векторами неудачной имплантации.

Хорошим прогностическим резервом, при условии что все остальные факторы фертильности в норме, является пролонгирование культивирования эмбрионов. И здесь необходимо отметить, что блокирование развития эмбрионов на 3-й или 4-й день культивирования во время активации генома эмбриона чаще всего зависит от особенностей спермы, а не яйцеклетки, особенно если на 3-й день эмбрион правильной формы и не фрагментирован. В заключение необходимо напомнить, что правильно собранный анамнез, адекватное обследование помогают принять правильное терапевтическое решение. Этот этап также помогает нам достичь максимальной эффективности лечения, при условии что эмбриологи также будут проводить селекцию эмбрионов. В случае неудачных попыток необходимо производить повторный анализ истории супружеской пары с учетом выявленных возможных причин неудач. Многие ли клиницисты и эмбриологи выполняют это? В то же время большинство пар с неудачными попытками ЭКО нуждаются в более индивидуализированном, адаптированном лечении. А правильно изложенная информация позволяет супружеским парам раньше обратиться к другим программам (донация яйцеклеток и эмбрионов, адаптация).

Заключение
Рецептивность матки зависит от влияния многих факторов, которые в дальнейшем участвуют в процессе имплантации. С первых моментов зарождения новой жизни начинается материнско-плодовый диалог, для понимания которого необходимо интегрировать множество механизмов. Расшифровка этого диалога, развитие диагностических возможностей, индивидуальная подготовка женщины к имплантации эмбриона представляет собой огромный резерв для будущего репродуктивной медицины.

Авторы: Гюльмамедова Е.А., Трофимова Е.А., Гюльмамедова И.Д., Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького, Донецкий региональный центр охраны материнства и детства
Цель: провести сравнительную оценку овариального резерва у пациенток с первым эффективным и первым неэффективным циклом экстракорпорального оплодотворения.
Материалы и методы: обследовано 50 супружеских пар. 24 пациентки с первым эффективным циклом вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) составили I группу; 26 пациенток с первым неэффективным циклом ВРТ составили II группу.
Результаты: у пациенток с неэффективным циклом ВРТ достоверно чаще наблюдался иммунологический фактор бесплодия, эндометриоидная болезнь, оперативные вмешательства на органах малого таза, снижение овариального резерва. Сниженный овариальный резерв наблюдался у 16,67 % пациенток с эффективным циклом (антимюллеров гормон 0,46–0,81 нг/мл) и у 46,15 % женщин с отсутствием беременности (антимюллеров гормон 0,1–0,9 нг/мл).
Выводы: определение уровня антимюллерова гормона играет важную роль при контролированной овариальной стимуляции в программе ВРТ у женщин с низким овариальным резервом.
Антимюллеров гормон (АМГ) (или Mullerianinhibiting substance (MIS)) — высокогликозилированный гомодимерический гликопротеин с двумя дисульфидными цепями — продуцируется только соматическими клетками гонад. Ген, кодирующий АМГ, расположен на коротком плече 19й хромосомы. АМГ — представитель суперсемейства трансформирующих факторов роста b (ТGFb), вместе с ингибинами и активинами выполняет различные функции в системе репродукции, процессах развития и дифференцировки эмбриона. У эмбрионов мужского пола АМГ продуцируется клетками Сертоли; индуцирует дифференцировку яичек и регрессирование мюллеровых протоков.

Ранние этапы развития женской репродуктивной системы проходят в отсутствие АМГ. Экспрессия АМГ в человеческом фетальном яичнике проявляется только с 32 недель гестации; исследования показывают, что АМГ необходим для развития маточных труб. АМГ впервые выделен в человеческой сыворотке 15 лет назад Lee et al. [1, 2]. У женщин концентрация АМГ в сыворотке низкая на протяжении препубертатного периода. До периода полового развития АМГ повышается только у дочерей от матерей с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ). АМГ присутствует в сыворотке взрослых людей обоих полов. У женщин сывороточная концентрация АМГ постепенно снижается в течение репродуктивного периода и приближается к нулю в менопаузе. Колебания уровня АМГ в сыворотке в течение менструального цикла несущественны, что говорит о том, что гормон не принимает участия в гипоталамогипофизарнояичниковой оси регуляции.

В яичнике синтез АМГ ограничен гранулезными клетками преантральных и ранних антральных фолликулов диаметром не более 4 мм. АМГ не определяется в примордиальных фолликулах. Экспрессия АМГ быстро повышается при переходе фолликула из преантральной в антральную стадию. Большие антральные (4–8 мм), доминантные и преовуляторные фолликулы не секретируют АМГ. Желтое тело на всех стадиях развития также не секретирует АМГ.

Выход фолликулов из примордиального пула происходит постоянно в течение репродуктивной жизни женщины до наступления менопаузы. Предполагают, что АМГ участвует в регуляции выхода фолликулов из состояния покоя, устанавливает темп, в котором фолликулы возобновляют мейоз, и регулирует скорость уменьшения примордиального пула. АМГ оказывает сдерживающее влияние на рост фолликула. Гранулезные клетки маленьких антральных фолликулов секретируют АМГ как в фолликулярную жидкость, так и в кровоток. АМГ является уникальным среди известных продуктов секреции фолликула, так как в доминантном фолликуле происходит снижение его синтеза. В отличие от ингибина В и яичниковых эстрогенов концентрация АМГ во время средней и поздней фолликулярной фазы отражает не функцию доминантного «фолликула месяца», а прежде всего дает информацию о числе маленьких фолликулов, входящих в фазу роста перед селекцией доминантного фолликула. Согласно этой гипотезе, экспрессия АМГ практически не зависит от факторов, которые подавляют поздние ФСГзависимые стадии развития фолликула (прием оральных контрацептивов, агонистов гонадотропинрилизинггормонов (ГнРГ), беременность) [3, 4].

Механизмы регуляции выхода пула примордиальных фолликулов из спящей стадии, их роста и возобновления мейоза остаются неизвестными. У мышей семейство TGFb кроме АМГ включает протеины морфогенеза кости 4, 7 и 15 , а также фактор роста и дифференцировки 9.

Загадка фертильности человечества состоит в остановке роста фолликулов в 1м мейотическом делении в фетальный период. Затем в течение многих лет женской репродуктивной жизни «избранные» фолликулы возобновляют фазу роста. Связь между ооцитом и окружающей его оболочкой гранулезных клеток играет ключевую роль в определении точки, в которой фолликул покидает фазу покоя. Процесс имеет сложную регуляцию и значительные межвидовые различия.

Только один фолликул в течение цикла становится доминантным и достигает овуляции, остальные подвергаются атрезии. Количество фолликулов, которые каждый месяц входят в фазу роста, с возрастом снижается и коррелирует с объемом пула оставшихся примордиальных фолликулов. Поэтому уровень АМГ можно рассматривать как маркер овариального резерва (ОР) (количество примордиальных фолликулов в яичниках в определенный период репродуктивной жизни женщины). ОР максимальный в последние месяцы фетальной жизни, затем непреклонно снижается до периода менопаузы, когда остается 1000 и менее фолликулов. Женщины отмечают прекращение менструаций и симптомы, присущие гипоэстрогении. Средний возраст наступления менопаузы в странах Запада составляет около 50–51 года, хотя границы колебания этого периода значительно шире (между 35 и 60 годами). Генетические и эпидемиологические исследования, включая близнецовый метод, доказывают, что на возраст наступления менопаузы в значительной мере влияет наследственность. Несмотря на многочисленные научнопопулярные публикации, влияние факторов окружающей среды на возраст менопаузы является ограниченным. Курение может приблизить возраст менопаузы на 1–2 года у длительно курящих женщин, выкуривающих до 20 сигарет в день, однако изменение образа жизни не обеспечивает продления репродуктивной жизни [5].

Таким образом, у женщин АМГ не определяется до начала пубертата, своего максимума достигает в период расцвета репродуктивной функции. Концентрация АМГ снижается в старшем репродуктивном возрасте. Сверхфизиологическая концентрация АМГ наблюдается у женщин с избытком маленьких антральных фолликулов (классический СПКЯ). В то же время концентрация АМГ аномально низкая у женщин с преждевременным истощением яичников или после химиотерапии [6, 7].

Методы измерения АМГ проходят этапы своего развития и совершенствования. Результаты могут быть выданы в пкмоль/л, нг/мл. Необходимо как можно быстрее провести стандартизацию в этом направлении [8, 9].

АМГ и другие маркеры овариального резерва. Термин ОР используется для описания количества и/или качества ооцитов в яичниках. Прямое измерение пула примордиальных фолликулов невозможно. Биопсия ткани яичника в сочетании с компьютерным подсчетом дают оценку ОР, однако клинически приемлемая (без вреда для пациентки) «маленькая» биопсия не позволяет точно просчитать число ооцитов, так как существует проблема неравномерного распределения фолликулов в яичниках. Понятие ОР является фундаментальным. Методы оценки ОР в клинической практике основаны на предположении о том, что число антральных фолликулов коррелирует с объемом большого пула примордиальных фолликулов.

Многочисленные исследования ОР основаны на результатах контролированной овариальной стимуляции (КОС) в цикле IVF. Число полученных ооцитов при этом — конечный итог оценки качества прогностических маркеров. Достоинство метода — возможность быстрой оценки ОР. Однако невозможно абсолютное соответствие результатов прогноза ОР и числа полученных ооцитов при IVF. Необходимо учитывать, что максимальная стимуляция яичников большими дозами ФСГ не является целью КОС. Правильно подобранная доза необходима для предотвращения риска синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ). Кроме того, количество полученных ооцитов при аспирации фолликулов зависит не только от ответа яичников на стимуляцию, но и от навыков хирурга и эмбриолога. Поэтому в какомто проценте случаев число полученных ооцитов может не совпадать с ОР.

Существуют и другие, более длительные и трудоемкие критерии оценки ОР, при которых определение АМГ производится в группе относительно молодых женщин в течение многих лет до менопаузы. Предварительное проспективное исследование выявило ожидаемое снижение АМГ у стареющих женщин.

Знание ОР имеет клиническое значение у пациенток программы IVF. Женщины с риском повышенного ответа (СГЯ) должны проходить более тщательный ультразвуковой и гормональный мониторинг, стартовая доза гонадотропинов у них должна быть значительно ниже. В то же время пациентки с ожидаемым низким ответом могут быть заранее предупреждены о том, что количество и качество ооцитов могут быть снижены. Это знание смягчает разочарование плохого ответа и делает возможным более быстрое окончание бессмысленного лечения.

Методы диагностики ОР разделяют на два типа. Биохимические тесты включают измерение базального уровня ФСГ, лютеинизирующего гормона, Е2, ингибина В.

В качестве альтернативы используют трансвагинальное ультразвуковое исследование. Оценивают кровоснабжение и объем яичников, проводят подсчет антральных фолликулов (ПАФ). Результаты многочисленных исследований показывают, что уровень АМГ более точно коррелирует с ОР, чем все другие тесты. Существует хорошая корреляция между уровнем АМГ, возрастом женщины, ПАФ и результатами IVF.

СПКЯ и риск овариальной гиперстимуляции. Исходя из физиологии секреции АМГ, при СПКЯ гранулезный слой каждого кистозноизмененного фолликула секретирует АМГ, что приводит к аномально высокой концентрации гормона как в фолликулярной жидкости, так в общем кровотоке. При СПКЯ существует взаимосвязь между уровнем сывороточного АМГ и ожирением, хотя у женщин с СПКЯ концентрация АМГ остается повышенной и при нормальной массе тела.

Критерии диагностики СПКЯ были приняты до проведения первых исследований секреции АМГ поликистозными яичниками. Поэтому АМГ не включен в триаду диагностики СПКЯ (гиперандрогения, ультразвуковые критерии, олиго или аменорея). Однако измерение АМГ может быть использовано для прогнозирования ответа яичников на индукцию овуляции кломифенцитратом или гонадотропинами, при лапароскопическом дриллинге яичников.

СГЯ остается наиболее серьезной угрозой для здоровья женщины. Процесс КОС включает ежедневное назначение рекомбинантного или мочевого ФСГ начиная со 2–3го дня менструального цикла. Экзогенное введение предотвращает физиологическое снижение ФСГ в естественном цикле. В натуральном цикле доминантный фолликул выступает в роли «кукушки в гнезде» и останавливает развитие других фолликулов путем секреции Е2 и ингибина В, что по принципу отрицательной обратной связи приводит к снижению уровня ФСГ. При проведении IVF механизм натуральной селекции отменяется путем введения экзогенного ФСГ. Это позволяет другим представителям фолликулярной когорты продолжать рост. В зависимости от овариального ответа при трансвагинальной пункции можно получить от 1 до 50 и более ооцитов.

Овариальный ответ на КОС значительно варьирует между индивидуумами, а также у одних и тех же женщин в разные периоды репродуктивной жизни. Количество ооцитов больше у молодых пациенток, особенно у женщин с СПКЯ. В идеале большинство клиник предпочитают получать от 6 до 15 ооцитов на пункцию. Это количество дает высокую вероятность получения одного или двух эмбрионов для переноса, избыточные эмбрионы для криоконсервации и дальнейшего использования. Хотя в этом случае у пациенток наблюдается супрафизиологическая концентрация Е2, риск развития СГЯ невысокий или же это осложнение будет протекать в мягкой форме.

К сожалению, у 5–10 % молодых женщин наблюдается гиперответ на введение ФСГ. Несмотря на многочисленные методы профилактики СГЯ, ни один из них не совершенен, и 1–2 % молодых женщин программы IVF требуют госпитализации. Из них в 30–50 % случаев требуется лапароцентез или кульдоцентез. Могут возникать многочисленные осложнения, такие как плевральный и перикардиальный выпоты, тромбоэмболия, смертельные исходы.

Это обусловливает огромную важность профилактики такого грозного осложнения. Для прогнозирования гиперответа применяют биохимические и биофизические маркеры. У пациенток с высоким риском развития СГЯ снижают стартовые дозы ФСГ, применяют протоколы с антагонистами ГнРГ, используют методы созревания незрелых ооцитов, полученных в естественном или стимулированном цикле in vitro, производят криоконсервацию эмбрионов с эмбриотрансфером в последующих циклах. Детальное обсуждение профилактики СГЯ выходит за рамки нашей статьи, но оно всегда основано на выявлении пациенток группы риска.

В последних научных работах показана важность измерения АМГ во время цикла, предшествующего КОС, для прогноза риска СГЯ.

Гипосекреторные состояния. Преждевременное истощение яичникового резерва (ПИЯР). Аномально низкое содержание АМГ в сыворотке может быть полезным в диагностике ПИЯР. Это необратимое явление, патогенез которого в большинстве случаев необъясним. Известна его связь с мозаицизмом при синдроме Тернера, хрупкой Ххромосомой, мутациями и полиморфизмом генов рецептора ФСГ, галактоземией. Другие случаи носят семейный характер, но их этиология не известна. Несмотря на то, что одна женщина из ста страдает тяжелой формой ПИЯР с полным прекращением менструаций к 40 (36) годам, намного больше женщин сталкиваются с бесплодием, обусловленным снижением количества и качества ооцитов после 30 лет. В современном обществе женщины откладывают первые роды к 30 и более годам. Эта демографическая тенденция приводит к резкому увеличению частоты необъяснимого бесплодия, обусловленного снижением ОР.

Термин «качество ооцита» используется как условное обозначение и характеризует аномалии ядра, митохондрий, цитоплазматической архитектоники. Эти отклонения чаще выявляются в ооцитах женщин старшего возраста, а также гипотетически лежат в основе плохого оплодотворения и развития эмбрионов после IVF у молодых женщин с ПИЯР. Плохой овариальный ответ с 4 или менее ооцитами является нормальным для женщин после 40, но может наблюдаться у молодых пациенток («плохие ответчики»). Наблюдается снижение как количества, так и качества ооцитов в этой группе женщин с необъяснимым бесплодием при условии спонтанной овуляции, отсутствии патологии маточных труб и эндометрия, нормальном анализе спермы. Научные публикации свидетельствуют о том, что «плохие ответчики» находятся на ранней стадии ПИЯР. Для них закономерно возрастание риска наступления трисомии во время беременности и раннего наступления менопаузы [10, 11].

Как продукт секреции гранулезных клеток, АМГ более точно отражает размер когорты растущих фолликулов, нежели качество и способность к оплодотворению потенциальных ооцитов, находящихся внутри фолликулов. Количество и качество ооцитов четко связаны с возрастом женщин, в то время как молодые «плохие ответчики» чаще всего имеют ооциты хорошего качества, о чем свидетельствует высокая частота наступления беременности после IVF.

Измерение уровня АМГ в сыворотке — надежный маркер ОР у женщин репродуктивного возраста [12, 13]. Анализ крови может быть взят в любую фазу менструального цикла [14, 15]. На уровень АМГ не влияет употребление пероральных контрацептивов или применение заместительной гормональной терапии (ЗГТ). Использование АМГ для определения ОР является новым и требует тщательного обсуждения перед введением в рутинную практику. Оценка уровня АМГ еще не автоматизирована, нормальный диапазон у большого количества здоровых волонтеров разного возраста продолжает уточняться. Тем не менее опубликованные исследования показали, что АМГ, как правило, эквивалентен числу антральных фолликулов при вагинальном ультразвуковом исследовании с меньшей вариабельностью от цикла к циклу и информативнее по сравнению с ФСГ или ингибином. Большой помехой для широкомасштабных исследований на здоровых волонтерах является длительный период наблюдения, который требует предварительного разделения на группы согласно возрасту наступления менопаузы для подсчета динамических возрастных изменений ОР.

Измерение АМГ информативно для подтверждения диагноза ПИЯР [6]. Многие пациентки с ПИЯР бесплодны и нуждаются в донации ооцитов, назначении ЗГТ для предотвращения остеопороза и облегчения симптомов климактерического синдрома. АМГ может быть использован как самостоятельный прогностический маркер или в комплексе с другими биохимическими или ультразвуковыми методами исследования. Низкая концентрация АМГ при планировании беременности ориентирует пациенток на более раннее проведение цикла IVF. Следует помнить и о том, что измерение АМГ дает информацию только об ОР. Имеют место другие многочисленные факторы, которые влияют на вероятность наступления беременности, включая трубный и мужской фактор.

Таким образом, АМГ является инновационным методом определения ОР. Его применение может быть полезным при диагностике и лечении яичниковой патологии и позволит здоровым женщинам установить продолжительность их последующей репродуктивной жизни. На протяжении последних 30 лет критерием оценки ОР было измерение ФСГ (менее надежный и удобный маркер) в раннюю фолликулярную фазу. Несмотря на отсутствие информации о длительных ретроспективных исследованиях прогностической ценности АМГ у женщин в возрасте от 30 до 50 лет, оправдано широкое применение этого нового маркера в репродуктивной гинекологии.

Цель исследования: провести сравнительную оценку овариального резерва у пациенток с первым эффективным и первым неэффективным циклом IVF.

Материалы и методы
Обследовано 50 супружеских пар, обратившихся для проведения первого цикла вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), с января 2011 г. по декабрь 2011 г. 24 пациентки с первым эффективным циклом составили I группу, 26 пациенток с первым неэффективным циклом составили II группу.

Результаты исследования
Возраст пациенток был от 24 до 44 лет и в среднем составил 32,70 ± 1,01 года у пациенток I группы и 32,16 ± 1,05 года у пациенток II группы (р > 0,05). Средний рост пациенток I группы — 165,74 ± 1,35 см, пациенток II группы — 164,92 ± ± 1,51 см (р > 0,05); вес — 65,91 ± 2,07 и 66,60 ± 2,74 кг (р > 0,05); МРИ — 24,07 ± 0,79 и 24,46 ± 0,93 соответственно (р > 0,05). Средний возраст менархе пациенток I группы был 13,43 ± ± 0,31 года; II группы — 12,93 ± 0,20 года (р > 0,05).

Нарушение менструального цикла наблюдалось у 5 (20,83 пациенток с успешным циклом ВРТ и у 4 (15,38 пациенток с неэффективным циклом (р > 0,05).

Продолжительность периода бесплодия в I группе составила 5,32 ± 0,97 года, во II группе — 5,68 ± 0,62 года (р > 0,05). Первичное бесплодие было у 15 (62,50 пациенток I группы и у 12 (46,15 пациенток II группы. Вторичное — у 9 (37,50 и у 14 (53,85 соответственно (р > 0,05).
Иммунологический фактор бесплодия выявлен у 4 (16,67 пациенток с первым эффективным циклом и у 18 (69,23 пациенток, у которых первая попытка была неэффективной (р < 0,05). Эндометриоидная болезнь была одним из факторов бесплодия у 4 (16,67 и у 13 (50,00 пациенток соответственно (р < 0,05). Трубноперитонеальная форма бесплодия была у 13 (54,17 пациенток I группы и у 18 (69,23 пациенток II группы (р > 0,05). Гидросальпинксы в анамнезе отмечены у 6 (25 пациенток с эффективным циклом и у 7 (26,92 — с отсутствием беременности (р > 0,05). Одна пациентка первой группы (4,17 и две — второй (7,69 отметили гидротубации в анамнезе. Миома матки различной локализации была у 3 (12,50 пациенток с эффективным циклом и у 6 (23,08 — с неэффективным ЭКО (р > 0,05). Оперативные вмешательства на органах малого таза отметили 3 (12,50 пациентки с эффективным циклом и 14 (53,85 пациенток с отсутствием беременности (р < 0,05) .

Мужской фактор бесплодия наблюдался у 17 (70,83 супружеских пар с первой эффективной попыткой ВРТ и у 14 (53,85 — с отсутствием имплантации (р > 0,05). Эти данные свидетельствуют о широком распространении мужского фактора бесплодия и о высокой эффективности эмбриологической лаборатории, которая нивелирует негативное влияние мужского фактора на эффективность ВРТ.

Отклонения эндокринного статуса наблюдались у 10 (41,67 пациенток I группы и у 17 (65,38 пациенток II группы (р < 0,09). Снижение ОР было у 4 (16,67 пациенток с эффективным и у 12 (46,15 — с неэффективным циклом (р < 0,05).

При анализе 4 амбулаторных карт пациенток со сниженным ОР и эффективным циклом ВРТ возраст женщин был от 29 до 37 лет, показатели АМГ колебались от 0,46 до 0,81 нг/мл. В цикле ВРТ у 3 пациенток было получено 5, у 1 — 4 ооцита. При проведении интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ — англ. ICSI) получено от 2 до 5 эмбрионов хорошего качества на цикл.

При анализе 12 амбулаторных карт пациенток со сниженным ОР и неэффективным циклом ВРТ возраст пациенток был от 26 до 42 лет, показатели АМГ колебались от 0,1 до 0,9 нг/мл. В цикле ВРТ у 12 пациенток было получено 42 ооцита (от 1 до 5 на пункцию). При проведении ИКСИ получено 30 эмбрионов (от 1 до 4), из них 15 эмбрионов с морфологическими отклонениями. Можно предположить, что причиной низкого качества ооцитов у женщин со сниженным ОР и неэффективным циклом ВРТ является высокая частота эндометриоидной болезни — 8 (66,67 случаев. У пациенток с низким овариальным резервом и эффективным циклом эндометриоидная болезнь наблюдалась в 1 случае (25 .

Выводы
1. У пациенток с неэффективным циклом ВРТ достоверно чаще наблюдались иммунологический фактор бесплодия, эндометриоидная болезнь, оперативные вмешательства на органах малого таза, снижение ОР.

2. Эндометриоз и оперативные вмешательства на органах малого таза являются факторами снижения ОР; сниженный ОР наблюдался у 16,67 % пациенток с эффективным циклом и у 46,15 % женщин с отсутствием беременности (р < 0,05).

3. Измерение уровня АМГ наряду с возрастом — информативный прогностический маркер ОР и ответа яичников на КОС. Для уточнения и детализации полученных результатов необходимо проведение дальнейших широкомасштабных исследований.

На правах рукописи
ЛЕВИАШВИЛИ Мзия Мерабовна
КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОДГОТОВКИ ЭНДОМЕТРИЯ К ПЕРЕНОСУ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
14.01.01 – Акушерство и гинекология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва – 2012
Работа выполнена в 1-ом гинекологическом отделении (отделение сохранения и восстановления репродуктивной функции) ФГБУ «Научный центра акушерства гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.
Научный консультант:
доктор медицинских наук Мишиева Нона Годовна
Официальные оппоненты:
Серебрянникова Клара Георгиевна - доктор медицинских наук, профессор кафедры семейной медицины с курсом экстрагенитальной патологии в акушерстве и гинекологии ФППОВ ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Калугина Алла Станиславовна - доктор медицинских наук, ассистент кафедры репродуктивного здоровья женщины ГБОУ ВПО «СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И.
Мечникова»
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»
Защита диссертации состоится «18» сентября 2012 г. в 13.00 ч. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.125.01 при ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан «___» августа 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Калинина Елена Анатольевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Криоконсервация эмбрионов значительно расширяет клинические преимущества и возможности циклов ЭКО, повышая кумулятивную частоту наступления беременности в расчете на один цикл стимуляции суперовуляции. Несмотря на почти 30 летнюю историю метода и постоянное совершенствование лабораторных этапов, эффективность криопереносов все еще остается низкой и по данным различных авторов составляет 10-30 % (Калинина Е.А., 2004; Вейсман А., 2010; Hodes-Wertz B., 2011).
В последние годы предметом активного обсуждения научного сообщества становится проблема повышения результативности криоциклов, эффективность которой определяется как качеством размороженных эмбрионов, так и структурно-функциональной полноценностью эндометрия (Edgar D., 2000; Margalioth E., 2006).
Согласно современным представлениям, в процессе имплантации важная роль принадлежит реципрокным взаимодействиям эндометрия с одной стороны, и бластоцисты, с другой стороны. Этот процесс опосредуется различными паракринными регуляторами: цитокинами, простагландинами, факторами роста, семейством молекул адгезии, компонентами межклеточного вещества и др. Изучение характера экспрессии молекул, вовлеченных в процесс имплантации, представляется перспективным в оценке рецептивности эндометрия (Achache H., 2006, Бурлев В.А., 2010; Dimitriadis E., 2010).
Наиболее активно в литературе обсуждается вклад в процесс имплантации лейкемия-ингибирующего фактора (ЛИФ). Этот цитокин продуцируется эндометрием на протяжении всего менструального цикла, однако, значительный подъем его экспрессии отмечается во второй половине фазы секреции (19-25-й день цикла) и сопряжен с периодом расцвета пиноподий (Aghajanova L., 2010; Hammoda M.A., 2012). Многие авторы отмечают важную роль гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста (ГС-ЭФР) в процессе имплантации. Максимальная экспрессия ГС-ЭФР в эндометрии также совпадает с расцветом пиноподий (Chobotova K., 2001; Lessey B., 2002; Ejskjaer K., 2005; Byun H., 2008).
Экспрессию маркеров в эндометрии можно оценить при иммуногистохимическом исследование соскобов секреторного эндометрия. Метод является инвазивным и при высокой информативности имеет свои ограничения - применим только в циклах обследования (Dimitriadis E., 2010). В связи с этим, актуальным является поиск неинвазивных методов, позволяющих оценить рецептивность эндометрия непосредственно в циклах переноса эмбрионов. Проведены исследования, обнаруживающие взаимосвязь экспрессии молекул в ткани эндометрия с его содержанием в смывах из полости матки и цервикальной слизи (LedeeBataille N., 2002; Mikolajczyk M., 2003; Gargiulo A.R., 2004). Однако эти работы не имеют пока клинической интерпретации и не применяются на практике.
Большое значение имеет выбор метода подготовки эндометрия к криопереносу. Анализ современной научной литературы показал, что наиболее часто в клинической практике применяют гормональную подготовку эндометрия препаратами эстрадиола и прогестерона, перенос размороженных эмбрионов в естественном овуляторном менструальном цикле, а также при стимуляции яичников небольшими дозами гонадотропинов (Gelbaya T.A., 2006; Chen S.L., 2007; Glujovsky D., 2010).
Значительный вклад в формирование успеха криоциклов ВРТ вносит качество размороженных эмбрионов. Скрупулезный отбор жизнеспособных эмбрионов с хорошим прогнозом выживаемости после размораживания имеет первостепенное значение для достижения успеха.
Следует отметить, что дискутабельным остается вопрос выбора наиболее эффективного метода криоконсервации эмбрионов (медленное замораживание или витрификация), а также наиболее подходящей для криоконсервации стадии развития преимплантационного эмбриона (Kuc P., 2010; Rosenwaks Z., 2011).
Результаты различных исследований достаточно противоречивы, поэтому представляется актуальным поиск диагностически ценных методов оценки рецептивности эндометрия, применимых на практике (как в циклах обследования, так непосредственно в циклах переносов эмбрионов), определение эффективности различных методов подготовки эндометрия к криопереносу, а также оптимизация эмбриологических этапов криоциклов.
В связи с вышеуказанным, целью исследования явилась:
оптимизация программ вспомогательных репродуктивных технологий с использованием криоконсервированных эмбрионов путем усовершенствования схем подготовки и ведения циклов переноса размороженных эмбрионов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценить клинико-анамнестические данные пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе для выявления ведущих факторов, предрасполагающих к нарушению рецептивности эндометрия.
2. Изучить анатомо-функциональное состояние эндометрия и его имплантационные свойства у пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе.
3. Определить наиболее диагностически значимые параметры оценки имплантационного потенциала эндометрия и установить их влияние на исходы программ ЭКО с использованием размороженных эмбрионов.
4. Изучить влияние метода криоконсервации (витрификация, медленное замораживание) на выживаемость и качество размороженных эмбрионов, а также результативность их переносов.
5. Провести сравнительный анализ и оценить эффективность различных протоколов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов.
6. Разработать алгоритм подготовки пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе к переносу криоконсервированных эмбрионов.
Научная новизна Определены клинико-анамнестические факторы, предрасполагающие к нарушению рецептивности эндометрия. Выявлены особенности рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными попытками ЭКО в анамнезе: при сохраненной морфологической структуре эндометрий характеризуется дисбалансом в экспрессии стероидных рецепторов и снижением формирования и созревания пиноподий.
Определен наиболее значимый диагностический маркер имплантиции - ЛИФ. Прослежена корреляционная зависимость между его экспрессией в эндометрии и концентрацией в цервикальной слизи.
Выявлены особенности экспрессии этого цитокина в эндометрии, присущие пациенткам с неудачами ЭКО в анамнезе.
Определены прогностически благоприятные критерии для наступления беременности: концентрация ЛИФ в цервикальной слизи в пределах 12-25 пг/мл, высокий уровень экспрессии ЛИФ в эпителии и железах эндометрия, а также более 40% клеток поверхностного эпителия с пиноподиями, и соотношение ПР/ЭР < 10.
Изучены особенности течения циклов переноса размороженных эмбрионов в зависимости от способа подготовки эндометрия. Определены критерии выбора протокола подготовки эндометрия в криоциклах.
Проведен анализ эффективности медленного замораживания эмбрионов и их витрификации на 5-й день культивирования по выживаемости эмбрионов и частоте наступления беременности (выявлена равнозначность методов).
Практическая значимость На основании полученных результатов разработан алгоритм обследования пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе.
Разработаны рекомендации для комплексной оценки имплантационных свойств эндометрия путем морфологического и иммуногистохимического исследования ткани эндометрия в период имплантационного окна, а также исследования цервикальной слизи. Выявлены наиболее диагностически ценные параметры оценки рецептивности эндометрия.
Определены клинические и лабораторные параметры, определяющие выбор протокола подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов в криоциклах ВРТ.
Установлено, что медленное замораживание бластоцист и их витрификация обладают одинаковой эффективностью и могут быть равнозначно использованы в зависимости от оснащенности и предпочтений эмбриологической лаборатории.
Положения, выносимые на защиту 1. При нормальных параметрах овариального резерва, а также адекватном фолликуло-, оо- и раннем эмбриогенезе неудачи в программах ЭКО могут быть связаны с нарушением имплантационных свойств эндометрия, на что указывает наличие негативных факторов (патология эндометрия, ИППП, повторные внутриматочные вмешательства), достоверно чаще встречающихся в анамнезе женщин с неудачными попытками ВРТ.
2. Прогностически неблагоприятными признаками для наступления беременности являются: концентрации ЛИФ в цервикальной слизи до 12 и от 25 пг/мл, снижение экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии и железах эндометрия, а также снижение количества клеток с наличием пиноподий менее 40% поверхностного эпителия, соотношение ПР/ЭР10.
Выявление указанных параметров обуславливает необходимость проведения подготовительной терапии.
3. Протоколы с гормональной подготовкой эндометрия и перенос размороженных эмбрионов в естественном цикле одинаково эффективны (частота наступления беременности - 23% и 26% соответственно). Выбор протокола зависит от исходных клинико-лабораторных характеристик пациенток. Способ криоконсервации эмбрионов 5-го дня культивирования не влияет на их выживаемость и частоту наступления беременности.
Личный вклад автора Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах исследования, анализе и обобщении полученных результатов.
Автором лично проводился отбор, обследование и лечение пациенток, статистическая обработка и научное обоснование результатов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 – акушерство и гинекология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 3 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.
Внедрение результатов в практику Результаты исследования внедрены в практическую работу 1-го гинекологического отделения (отделение сохранения и восстановления репродуктивной функции) ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 в ведущих рецензируемых научных журналах определенных ВАК.
Апробация работы Основные положения диссертации и результаты работы доложены на XXI ежегодной международной конференции Российской ассоциации репродукции человека (Санкт-Петербург, 2011) и VI международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012).
Работа обсуждена на конференции сотрудников 1-го гинекологического отделения ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (09.04.2012) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития РФ (16.04.2012, протокол №8).
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 139 страницах, содержит 28 рисунков и 20 таблиц. Список литературы содержит 1работ, в том числе 155 зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования Для достижения цели исследования и решения поставленных задач работа выполнялась проспективно в три этапа (рисунок 1).
Основная группа (n=228) пациентки с 2 Группа сравнения (n=30) пациентки с I этап неудачными программами ЭКО в анамнезе бесплодием в анамнезе, у которых беременность наступила в 1 или 2 программе Группа исследования (n=79) пациентки, Группа контроля (n=8) фертильные женщины, которым проводилось углубленное исследование которым проводилось углубленное исследование II этап рецептивности эндометрия рецептивности эндометрия Группа I (n=19) Группа II (n=26) Группа III (n=16) перенос размороженных эмбрионов перенос эмбрионов в цикле с перенос размороженных производился в цикле с гормональной применением «мягких» схем эмбрионов производился в III этап стимуляции овуляции подготовкой эндометрия естественном цикле Рисунок 1. Дизайн исследования.
На первом этапе работы было обследовано 228 бесплодных женщин с 2-мя и более неудачными программами ЭКО в анамнезе, обратившихся в отделение сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России для продолжения лечения бесплодия методом переноса криоконсервированных эмбрионов в 2009-2011г.г.
Критериями включения пациенток в исследование явились:
наличие 2 более неудачных попыток ЭКО в анамнезе; возраст пациенток от 20 до 38 лет включительно; отсутствие гинекологических заболеваний, влияющих на репродуктивную функцию и рецептивность эндометрия;
отсутствие соматических, эндокринных и психических заболеваний в стадии декомпенсации, а также, злокачественных новообразований органов репродуктивной системы.
Для оценки значимости различных клинико-анамнестических данных в прогнозировании имплантационного потенциала эндометрия и исходов программ ЭКО на данном этапе работы была сформирована группа сравнения, состоящая из 30 пациенток с бесплодием в анамнезе, у которых беременность наступила в 1-ой или 2-ой программе ЭКО.
При сборе анамнеза оценивали менструальный цикл и репродуктивный анамнез пациентки. Особое внимание обращали на наличие в анамнезе оперативных вмешательств на органах малого таза, в том числе и гистероскопии. Большой интерес представляло ранее проведенное лечение бесплодия. Детально изучали клинические и эмбриологические параметры предыдущих программ ЭКО: толщину и структуру эндометрия в программах ВРТ, динамику роста фолликулов, способ оплодотворения, оогенез (количество и зрелость полученных ооцитов) и эмбриогенез, а также количество криоконсервированных эмбрионов, стадия развития эмбрионов, на которой была произведена криоконсервация, методы и протоколы криоконсервации.
На втором этапе работы проводили углубленное исследование имплантационных свойств эндометрия у 79 ранее обследованных женщин основной группы и 8 фертильных женщин репродуктивного возраста с регулярным менструальным циклом, имеющим в анамнезе самостоятельную беременность и роды, составивших группу контроля.
Обследование проводили по следующему алгоритму:
для оценки состояния органов малого таза на 3-5 день цикла производили УЗ исследование (отделение функциональной диагностики ФГБУ НЦ АГиП Минздравсоцразвития России, руководитель - профессор Гус А.И.);
в дальнейшем для динамической оценки роста и созревания фолликула, констатации овуляции, развития желтого тела, а также оценки толщины и структуры эндометрия производили УЗ-мониторинг цикла;
на 6-8-й день после овуляции, которую отслеживали совместно 2 методами (УЗ мониторинг цикла и функциональные тесты, для определения пика ЛГ в моче), также осуществляли УЗИ для оценки толщины и структуры эндометрия, после чего производили забор цервикальной слизи и пайпельбиопсию эндометрия.
Забор цервикальной слизи (ЦС) производили урогенитальным «велюр-зондом» фирмы «Copan» (Италия). Анализ образцов проводили методом ИФА в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ ”НЦ АГиП им. В.И.Кулакова” Минздравсоцразвития России (руководитель – д.м.н.
Кречетова Л.В.). Концентрацию ЛИФ в цервикальной слизи определяли наборами тест-систем фирмы «Bender Medsystems» (cotol. № 242, США);
концентрацию ГС-ЭФР - наборами фирмы «Ray Biotech» (cotol. № ELH HB-EGF-001, США).
Биопсию эндометрия проводили под ультразвуковым контролем из области дна матки с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier (”Laboratoire C.C.D.”, Франция). Исследование препаратов проводили в световом микроскопе при увеличении от х50 до х400. Гистологические заключения формулировали в 1-ом патологоанатомическом отделении ФГБУ ”НЦ АГиП им. академика В.И.Кулакова” Минздравсоцразвития России (руководитель - д.м.н., профессор Е.А.Коган) в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах (Кондриков Н.И., 2008; Mazur M.T., 2005).
Также проводили оценку процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении х4в 5 полях зрения.
При иммуногистохимическом анализе (ИГХ) для визуализации реакций применяли универсальный пероксидазный набор LSAB+kit («DAKO», США). Определение стероидных рецепторов проводили с использованием мышиных моноклональных антител к эстрогеновым рецепторам (клон 1D5 «DAKO», США; разведение 1:35) и прогестероновым рецепторам (клон 636 «DAKO», США; разведение 1:50).
Для оценки экспрессии ЛИФ использовали первичные антитела к LIF (R@D Systems, USA, clone: 9824, mouse anti-human antibody 1:100), экспрессии ГС-ЭФР – первичные антитела к ГС-ЭФР (R@D Systems, USA, anti-goat antibody 1:100).
Результаты для ЭР и ПР оценивали с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета HISTO Score по формуле: HS=1а+2b+3c, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток; 1,2,3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 % – отсутствие экспрессии, 11-1% – слабая экспрессия, 101-200 % – умеренная экспрессия, 201-300 % – выраженная.
Результаты ИГХ для ЛИФ и ГС-ЭФР оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике:
отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) – 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) – 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) – 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) – 4 балла;
более 40% окрашенных клеток (+++) – 6 баллов.
На третьем этапе работы проводили оценку эффективности разных протоколов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов. С этой целью, ранее обследованные пациентки группы исследования были произвольным образом разделены на 3 группы:
Группа I - 19 пациенток, которым перенос эмбрионов осуществлен в естественном овуляторном цикле;
Группа II - 26 пациенток, у которых подготовку эндометрия проводили гормональными препаратами;
Группа III - 16 пациенток, у которых перенос криоэмбрионов проводили в цикле на фоне «мягких» схем стимуляции овуляции.
В натуральном менструальном цикле перенос размороженных эмбрионов проводили на 6-7 день после овуляции, которую отслеживали при УЗ-мониторинге цикла и определении пика ЛГ в мочи. При подготовке эндометрия гормональными препаратами с 3-го дня менструального цикла вводили препараты эстрадиола валерата, доза подбиралась индивидуально (4-12 мг/сут), далее c 14-15-го для цикла присоединяли микронизированный прогестерон в дозе 400-600 мг/сут. Перенос эмбрионов осуществляли на 5-6 день введения препаратов прогестерона.
При переносе размороженных эмбрионов в цикле со стимуляцией функции яичников индукцию овуляции проводили с 5-го дня менструального цикла прямыми индукторами в дозе 50-150 МЕ в сутки (чМГ или р-ФСГ). При достижении фолликулов преовуляторных размеров (17-20 мм) назначали триггер овуляции (чХГ в дозе 5-8 тыс. Ед.), а после констатации овуляции - поддержку лютеиновой фазы препаратами прогестерона. Перенос размороженных эмбрионов в полость матки осуществляли на 5-6-й день введения препаратов прогестерона.
В циклах криопереносов проводили анализ клинических и эмбриологических этапов.
Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц ”Microsoft Excel” и пакета программ ”Statistica for Windows” версии 7.0, StatSoft Inc. (США).
Все полученные количественные (анамнестические, клинические, лабораторные, инструментальные) данные обработаны методом вариационной статистики. Для количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратическое отклонение (), ошибка среднего (m), медиана (Me), 95% доверительный интервал, для качественных данных – частота (. Для сравнения числовых данных (после проверки на нормальное распределение) использовали метод дисперсионного анализа и t-критерий Стьюдента для 2-х независимых выборок. Для сравнения непараметрических данных применяли методы Круаскала-Уоллиса (для нескольких групп), попарное сравнение осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни для несвязанных совокупностей.
Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод 2 с поправкой Йетса на непрерывность, для вычисления которого прибегали к построению сетки ”2х2” и ”3х2”, а также точный критерий Фишера для небольших выборок. Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95%-уровень значимости).
Связь между изучаемыми показателями оценивалась по результатам корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Пирсона ® и последующим установлением его значимости по критерию t.
Яндекс.ДиректКонструкции алюминиевые и ПВХ. Производство алюминиевых конструкций. От производителя! Разумные цены. alumprom.ru Алюминиевая система INICIAL Производство профиля для окон/ дверей/ фасадов. Новейшие технологии! Адрес и телефон inicial.ru
Показатель корреляции менее 0,25 считали незначимым; 0,25-0,70 – корреляционная связь считалась умеренной; от 0,7 и выше – сильной (Реброва О.Ю., 2002).
Результаты исследования и их обсуждение На первом этапе работы было обследовано 228 пациенток с бесплодием, имеющих неудачные программы ЭКО в анамнезе, которые обратились для переноса криоконсервированных эмбрионов. Средний возраст пациенток составил 32,5 ± 3,5 года, длительность бесплодия в среднем - 4,4±2,0 года. Первичное бесплодие отмечалось у 104 (46 , вторичное - у 124 (54 пациентов. На перенесенные гинекологические операции в анамнезе указывали большинство пациенток, из них 184 (81%) перенесли от 1 до 3 лапароскопических вмешательств. Внутриматочные хирургические манипуляции (гистероскопии и ДВ) произведены 2пациенткам (90 , причем 144 (63 из них 2 и более раз.
Всем пациенткам основной группы ранее было проведено более 2-х попыток ЭКО (2,3±0,5): с использованием протоколов с аГнРГ в 63,6% и с антГнРГ в 36,4% случаев. При этом параметры фолликуло-, оо- и раннего эмбриогенеза, а также толщина и структура эндометрия в индуцированном цикле соответствовали нормальным значениям (таблице 1).
Таблица Параметры фолликуло-, оо- и эмбриогенеза циклов ЭКО пациенток группы обследования Параметры На 1 цикл Количество растущих фолликулов 15,6±9,Количество аспирированных фолликулов 15,0±8,Количество полученных ооцитов /из них зрелых 14,7±8,0/74% Метод оплодотворения ЭКО/ИКСИ 62%/38% 2-е сутки после ТВП - количество эмбрионов 2PN 12,2±5,3-е сутки после ТВП – эмбрионы с 6-8 бластомерами 9,9±3,/из них класса А и В фрагментации цитоплазмы 29% и 43% 5-ые сутки культивирования - количество бластоцист 8,2±3,Количество перенесенных эмбрионов 2,1±0,Количество криоконсервированных эмбрионов 4,4±2,Толщина эндометрия в день переноса эмбрионов, мм 10,0±1,Для выявления факторов, предрасполагающих к нарушению рецептивности эндометрия, проводили оценку различных клиникоанамнестических данных. На этом этапе работы была сформирована группа сравнения, состоящая из 30 пациенток с бесплодием в анамнезе, у которых беременность наступила в 1-й или 2-й программе ЭКО.
Пациентки группы сравнения были сходны по возрасту (средний возраст 31,8±3,7 лет) и имели нормальный овариальный резерв. В циклах ЭКО у них также регистрировались адекватные параметры фолликуло-, оо- и эмбриогенеза. Толщина и структура эндометрия при УЗ-мониторинге в программах ЭКО у них также не отличались от нормативных показателей.
Тем не менее, удалось выявить различия в клинико-анамнестических характеристиках пациенток (таблица 2).
Установлено, что среди группы женщин, у которых беременность наступила, в анамнезе достоверно реже производились повторные внутриматочные манипуляции (искусственные аборты, гистероскопии и ДВ) и реже использовали с целью контрацепции ВМС, а также достоверно реже встречались патологии эндометрия и инфекции, передающиеся половым путем.
Таблица Сравнительный анализ клинико-анамнестических данных пациенток основной группы и группы сравнения Параметры Основная группа Группа сравнения репродуктивного здоровья (n=228) (n=30) Хронический сальпингоофорит 47% 49% Патология эндометрия (гиперплазия, 41% * 13% синехии, полипы) Заболевания шейки матки 30% 27% ИППП 44% * 25% Миома матки 8% 10% НГЭ I-III ст. 9% 9% Спаечный процесс в малом тазу 19% 17% Хронический эндометрит 25% 20% Лапароскопические операции 81% 63% Гистероскопия и ДВ 27% * 53% 2 и более гистероскопии и ДВ 63% * 20% Своевременные роды 14% 13% Самопроизвольные аборты 15% 15% Искусственный аборт 19% 20% 2 и больше искусственных аборта 37% * 18% Внематочные беременности 43% 45% Использование ВМС с целью контрацепции 20% * 7% * - p0,05 – имеются достоверные различия с группой сравнения Таким образом, при анализе клинических и эмбриологических параметров ранее проведенных программ ЭКО не было найдено отклонений, но в анамнезе пациенток основной группы выявлены факторы, предрасполагающие к нарушению рецептивности эндометрия.
Все это явилось предпосылкой для углубленного изучения имплантационных свойств эндометрия у данной группы больных.
На втором этапе работы 79 ранее обследованным пациенткам (группа исследования), а также 8 фертильным женщинам репродуктивного возраста (31,3±3,8), составившим группу контроля произвели морфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия.
При морфологическом исследовании биоптатов фертильных женщин (n=8) наблюдали эндометрий ранней и средней стадии фазы секреции, зрелые пиноподии имели в среднем 50±7,7% клеток поверхностного эпителия (от 40 до 60 . Признаки хронического эндометрита в этой группе женщин отсутствовали.
Морфологическое датирование эндометрия в группе исследования выявило, что у 78 женщин был обнаружен эндометрий ранней и средней стадии фазы секреции (рисунок 2) и лишь у одной женщины наблюдали эндометрий поздней стадии фазы пролиферации. Пиноподии покрывали в среднем 27,3±15,1% клеток поверхностного эпителия (от единичных до % клеток). Снижение количества зрелых пиноподий было отмечено и исследователем Nikas G. (2002) у пациенток с нарушением имплантации в анамнезе и у женщин с бесплодием неясного генеза. При морфологическом исследовании у 18 женщин были выявлены остаточные явления хронического эндометрита - эти пациентки были исключены из группы исследования, которую теперь составили 61 пациентка.
А Б Рисунок 2. Морфологическое исследование эндометрия пациентки Н. группы исследования:
оценка количества клеток покровного эпителия со зрелыми пиноподиями. Окраска гематоксилином и эозином: А - х200, Б - х400.
При оценке экспрессии стероидных рецепторов у женщин составивших группу исследования наблюдали умеренную и выраженную экспрессию ПР и умеренную и низкую экспрессию ЭР в эпителиальных, железистых структурах и строме эндометрия (рисунок 3).
А Б Рисунок 3. Иммунопероксидазная реакция с рецепторами к стероидным гормонам.
Эндометрий стадии секреции пациентки М. группы исследования: А - ЭР (х200), Б – ПР (х200).
В группе фертильных женщин выявлена умеренная экспрессия ПР и ЭР во всех оцениваемых клеточных структурах эндометрия (таблица 3).
Таблица Экспрессия стероидных рецепторов в ткани эндометрия, оцениваемая по системе H-Score Локализация Группа исследования (n=61) Группа контроля (n=8) рецепторов ПР-эпителий ( 151,9±89,5 % 147,1±82,9 % ПР-железы ( 147,2±81,3 % 141,2±79,1 % ПР-строма ( 144,3±73,5 % 144,3±75,6 % ЭР-эпителий ( 90,5±54,3 % 71,4±32,9 % ЭР-железы ( 86,8±73,6 % 66,3±42,7 % ЭР-строма ( 49,6±49,3 % 59,0±43,0 % Соотношение ПР/ЭР 8,1±3,4* 3,0±0,* - p0,05 - достоверное отличие с группой контроля.
Что касается соотношения рецепторов стероидных гормонов в эндометрии, то этот показатель рассчитывали по соотношению ПР/ЭР в строме. У пациенток группы исследования соотношение ПР/ЭР колебалось от 1 до 180 и в среднем составило 8,1±7,7 (что отражает снижение количества эстрогеновых рецепторов). В группе контроля показатель оказался в диапазоне от 2 до 5 и в среднем составил 3,0±0,8. За норму мы приняли значения, полученные при обследовании фертильных женщин (ПР/ЭР = 2-5), что также соответствует данным, которые получили другие авторы (Дюжева Е.А. 2010, Talbi S. 2006). Было установлено, что в группе исследования достоверно меньшее количество женщин (25% пациенток против 100% среди фертильных женщин, p0,05) имели этот показатель в пределах нормы.
При оценке экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора в эндометрии фертильных женщин отмечена высокая степень экспрессии маркера (5-6 баллов). Тогда как, в образцах, полученных у пациенток с безуспешными программами ЭКО в анамнезе, экспрессия этого цитокина варьировала от полного отсутствия до высокой, в среднем оставаясь достоверно ниже уровня группы контроля (таблица 4), что отражает нарушение его имплантационных свойств.
Таблица Экспрессия ЛИФ в ткани эндометрия Локализация Группа исследования (n=61) Группа контроля (n=8) Эпителий (баллы) 3,0±0,8 * 5,0±0,Пиноподии (баллы) 2,5±1,0 * 5,1±0,Строма (баллы) 2,9±1,7 3,1±1,* - p0,05 - достоверное отличие с группой контроля.
При оценке взаимосвязи количества клеток поверхностного эпителия с пиноподиями и уровня экспрессии ЛИФ была отмечена умеренная корреляция признаков (r=0,35), что согласуются с данным Agajanova L. и соавт. (2004). Эти факты подтвердили высокую диагностическую ценность оценки экспрессии ЛИФ в определении имплантационного потенциала эндометрия.
При изучении экспрессии гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста (ГС-ЭФР) в ткани эндометрия не удалось выявить достоверной разницы в экспрессии фактора в образцах группы исследования и контроля, хотя, в работах других исследователей (Lessey B.A., 2006, Амбарцумян Э.М., 2004) было отмечено снижение экспрессии фактора в эндометрии женщин с бесплодием. В группе исследования экспрессия ГС-ЭФР была незначительно ниже, чем в группе контроля (4,0±0,8 и 4,5±1,0 против 5,1±0,2, 5,3±0,6; p>0,05).
Одной из важных задач, которую мы ставили перед собой, был поиск неинвазивных методов оценки имплантационных свойств эндометрия, применимых не только в циклах обследования, но и в циклах переноса эмбрионов. Для решения этой задачи определяли концентрацию ЛИФ и ГС-ЭФР в цервикальной слизи (ЦС) и экспрессию этих маркеров в ткани эндометрия в период имплантационного окна.
При иммуноферментном анализе цервикальной слизи у фертильных женщин концентрация ЛИФ составила 12-25 пг/мл (20±3,6 пг/мл в среднем), у пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе этот показатель значительно варьировал (от 0 до 38 пг/мл) и в среднем составил 19±8,6 пг/мл (таблица 5).
Таблица ЛИФ в цервикальной слизи и ткани эндометрия Группа исследования (n=61) Группа контроля (n=8) ЛИФ в цервикальной 0 – 38 (19 ± 8,6) 12 - 25 (20 ± 3,6) слизи (пг/мл) Экспрессия ЛИФ в ткани 0 – 6 (3,0±0,8)* 5 – 6 (5,3±0,8) эндометрия (баллы) * - p0,05 - достоверное отличие с группой контроля.
Отмечена строгая взаимосвязь между уровнем экспрессии ЛИФ в ткани эндометрии и его концентрацией в цервикальной слизи (r=0.68), что не противоречит публикациям Амбарцумян Э.М. (2003; 2004).
При изучении в ЦС содержания ГС-ЭФР было установлено, что этот показатель варьировал в значительной степени в обеих группах. В среднем он составил 13,3±9,6 среди женщин группы исследования и 12,2±9,4 у фертильных женщин (p>0,05). При оценке взаимосвязи между экспрессией ГС-ЭФР в ткани эндометрия и его концентрацией в цервикальной слизи была отмечена крайне слабая корреляционная связь признаков (r=0,16).
Мы провели анализ прогностической ценности оценки имплантационного потенциала и исходов криопереносов для всех исследуемых параметров. Значимые показатели относительности шансов были выявлены лишь для некоторых из них (таблица 6).
Таблица Диагностической ценности параметров оценки рецептивности эндометрия Беременность Беременность Отношение шансов Параметры наступила не наступила p OR (95% ДИ) (n=13) (n=48) Пиноподии занимают 40% 8.10 (77%) 13 (27%) 0,00клеток поверх. эпителия (2,1-37,8) Высокая экспрессия ЛИФ в 9.8 (61%) 7 (14.6%) 0,00эндометрии (5-6 баллов) (2,4-37,1) 8,ПР/ЭР 10 12 (92%) 28 (58%) 0,00(1,03-71,3) Концентрация ЛИФ в ЦС 6.10 (77%) 17 (35%) 0.0012-25 пг/мл (1,5-25,1) При морфологическом исследовании и ИГХ достоверно оценить перспективы имплантации позволяют: процент клеток поверхностного эпителия со зрелыми пиноподиями и уровень экспрессии ЛИФ, а также баланс стероидных рецепторов в эндометрии; при исследовании цервикальной слизи - концентрация цитокина ЛИФ. Неинформативным оказалось исследовании ГС-ЭФР как в ткани эндометрия, так и в ЦС.
Яндекс.ДиректКвартира посуточно Киевская 2-ком квартира рядом с метро. Для 5 гостей flatcenter.ru


Таким образом, низкая экспрессия ЛИФ в поверхностном эпителии и железах эндометрия и изменение его концентрации в цервикальной слизи (за норму мы принимали значения, полученные при обследовании фертильных женщин), а также снижение количества пиноподий в среднесекреторную фазу, являются негативными прогностическими признаками и отражают нарушение имплантационных свойств эндометрия. Неблагополучным признаком является также выраженный дисбаланс в экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии (ПР/ЭР10).
На третьем этапе исследования ранее обследованным пациенткам группы исследования произвели переносы эмбрионов в криоцикле ВРТ.
Пациентки были произвольным образом разделены на 3 группы в зависимости от применяемого протокола подготовки эндометрия. В группе I перенос производили в естественном цикле (n=19); в группе II - подготовку эндометрия препаратами эстрадиола и прогестерона (n=26); а группе III (n=16) - перенос эмбрионов осуществляли на фоне «мягких» схем стимуляции овуляции. Все размороженные и перенесенные эмбрионы были криоконсервированы на стадии бластоцисты, причем в 28 случаях (46%) методом медленного замораживания и в 33 случаях (54%) эмбрионы были витрифицированы.
Проведен сравнительный анализ клинико-анамнестических данных ранее проведенных циклов между пациентками различных групп - достоверных отличий в репродуктивном анамнезе, овариальном резерве и клинико-эмбриологических параметрах найдено не было.
Изучение особенностей протоколов мы проводили по клиническим и эмбриологическим параметрам. Следует отметить, что не было ни одной отмены запланированного переноса в связи с неудовлетворительным качеством полученных после размораживания эмбрионов или по состоянию эндометрия на день переноса.
При подготовке эндометрия препаратами эстрадиола средняя доза эстрадиола валерата, применяемого в группе II из расчета на цикл составила 102,7±10,8 мг (с 3-го по 28-й день). Доза использованного прямого индуктора из расчета на цикл стимуляции составила в среднем 540±10 МЕ (группа III).
При анализе клинико-эмбриологических аспектов криоциклов установлено, что толщина эндометрия в день переноса была достоверно меньше в естественных циклах и в среднем составила 9,2±1,2 (против 11,2±1,4 и 10,4±1,5 в группах II и III соответственно) (таблица 7). Наиболее эффективными оказались протоколы с гормональной подготовкой эндометрия и перенос эмбрионов в естественном менструальном цикле – 26% и 23% соответственно против 13% в протоколах со стимуляцией овуляции.
Таблица Сравнительная характеристика циклов переносов, при различных протоколах подготовки эндометрия.
Группа I Группа II Группа III Параметры (n=19) (n=26) (n=16) Доминантный фолликул, шт. 1 * - 2,4±1,Овуляция (УЗИ, пик ЛГ в моче), день м/ц 15,7±1,6 * - 14,0±0,Толщина эндометрия на 13-15 день м/ц 8,0±1,0 *,*** 9,3±0,8 9,0±1,6-11*,*** 8-14 7-Толщина эндометрия в день ПЭ, мм (9,2±1,2) (11,2±1,4) (10,4±1,5) ПЭ, день м/ц 21,8±2,0 *,*** 19,6±0,9** 20,0±0,Разморожено эмбрионов, шт./выживаемость 2,7±0,4/75% 2,9±0,3/71% 3,0±0,7/71% Число перенесенных эмбрионов, шт. 2,2±0,2 2,4±0,5 2,2±0,Клиническая беременность 5 (26%)* 6 (23%) 2 (13%) * - p0,05 – имеются достоверное отличие между группами I и III, ** - p0,05 – имеются достоверные отличия между группами II и III, *** - p0,05 – имеются достоверные отличия между группами I и II.
При сравнении эффективности методов криоконсервации (медленное замораживание и витрификация) достоверной разницы в выживаемости эмбрионов (71,5% и 72,1% соответственно) или в исходах циклов (частота клинической беременности 21% в обоих случаях) выявлено не было.
Было проведено сравнение протоколов внутри групп исследования, между пациентками с положительным и отрицательным исходом криопереноса. Анализ данных показал, что при переносе эмбрионов в естественном цикле беременность наступила у пациенток более молодого возраста с 28-дневным менструальным циклом и с овуляцией на 13-15-й день цикла. В группе II и III у пациенток с положительным исходом в день переноса эмбрионов толщина эндометрия была достоверно больше.
Таким образом, скрупулезный анализ клинико-анамнестических данных, выявление в анамнезе факторов, предрасполагающих к нарушению рецептивности эндометрия, определяет необходимость проведения углубленного исследования имплантационных свойств эндометрия и при необходимости назначение подготовительной терапии (рисунок 4).
Наличие в анамнезе 2 безуспешных попыток ЭКО в анамнезе Углубленное обследование структурно-функционального состояния эндометрия Выявление Нарушение Дисбаланс в Нарушение Отсутствие органической органической формирования экспрессии экспрессии патологии эндометрия патологии и созревания стероидных ЛИФ в В среднесекреторной фазе эндометрия пиноподий рецепторов эндометрии зрелые пиноподии покрывают 40% клеток поверхностного эпителия подготовительная терапия Соотношение ПР/ЭР и контрольное исследование Высокая и/или умеренная состояния эндометрия экспрессия ЛИФ в эпителии и железах ЛИФ в ЦС от 12 до пг/мл cryoET Рисунок 4. Алгоритм подготовки пациенток к криопереносу.
ВЫВОДЫ 1. Ведущими факторами, негативно влияющими на рецептивность эндометрия при неудачных попытках ЭКО, являются повторные внутриматочные вмешательства, выявленные у 67%, патология эндометрия - у 41% и инфекции, передающиеся половым путем - у 44% пациенток.
2. Имплантационные свойства эндометрия, при его нормальной морфологической структуре у пациенток с безуспешными попытками ЭКО в анамнезе характеризуются дисбалансом в экспрессии стероидных рецепторов (за счет уменьшения экспрессии рецепторов к эстрогенам) у 75% из них и нарушением формирования и созревания пиноподий у 70%.
3. Экспрессия ЛИФ в эндометрии отражает его имплантационный потенциал.
Концентрация ЛИФ в цервикальной слизи коррелирует с его экспрессией в ткани эндометрия (r=0,68) и может служить неинвазивным методом оценки имплантационных свойств эндометрия. Содержание ГС-ЭФР в ткани эндометрия и в цервикальной слизи у пациенток с неудачами ЭКО в анамнезе не имеет значимых различий по сравнению с группой фертильных женщин.
4. Прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются: концентрация ЛИФ в цервикальной слизи в пределах 12-пг/мл, высокий уровень экспрессии ЛИФ в эпителии и железах эндометрия, а также наличие в период «имплантационного окна» более 40% клеток поверхностного эпителия с пиноподиями и соотношение ПР/ЭР < 10.
5. Медленное замораживание эмбрионов и их витрификация на 5-й день культивирования являются равнозначными по эффективности:
выживаемость эмбрионов после размораживания составила 71,5% и 72,1% соответственно, частота наступления беременности при обоих видах криоконсервации– 21%.
6. Протоколы с гормональной подготовкой эндометрия и перенос размороженных эмбрионов в естественном цикле одинаково эффективны по частоте наступления беременности – 23% и 26% соответственно. Выбор протокола зависит от исходных клинико-лабораторных характеристик пациенток.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Пациенткам с неудачными программами ЭКО в анамнезе, имеющим криоконсервированные эмбрионы, перед их переносом необходимо провести исследования, направленные на оценку рецептивных свойств эндометрия в период «имплантационного окна»: морфологические датирование эндометрия, выявление признаков хронического эндометрита, определение уровня экспрессии ЛИФ в эндометрии, а также изучение формирования и созревания пиноподий и оценка баланса стероидных рецепторов.
2. Нарушение экспрессии ЛИФ в эндометрии, снижение формирования пиноподий, дисбаланс в экспрессии стероидных рецепторов свидетельствуют о снижении имплантационных свойств эндометрия и требуют подготовительной терапии.
3. В циклах криопереносов целесообразно исследовать цервикальную слизь в период имплантационного окна: концентрация ЛИФ менее 12 пг/мл и более 25пг/мл свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия, что, в свою очередь, может быть аргументом для отмены переноса.
4. Такие данные как преобладание экспрессии ЛИФ в строме эндометрия и повышение его концентрации в цервикальной слизи выше 45 пг/мл отражают наличие хронического эндометрита и могут быть рекомендованы как дополнительные критерии его диагностики.
5. Медленное замораживание бластоцист и их витрификацию можно рассматривать как методы криоконсервации, обладающие одинаковой эффективностью, и использовать тот или иной способ в зависимости от оснащенности и предпочтений эмбриологической лаборатории.
6. Женщинам, имеющим регулярный 28-дневный менструальный цикл с овуляцией на 13-15-й день цикла, толщиной эндометрия в день переноса эмбрионов не менее 9 мм, предпочтительней переносить размороженные эмбрионы в естественном менструальном цикле.
7. При отсутствии условий, перечисленных в предыдущем пункте, целесообразно переносить размороженные эмбрионы на фоне заместительной гормональной терапии.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Оценка морфологии преимплантационных эмбрионов на различных стадиях развития in vitro (обзор литературы) /М.М. Левиашвили, Н.Г.
Мишиева, Н.Ю. Костромина, Т.А. Назаренко //Проблемы репродукции.
2011. №3. С. 74-79.
2. Оценка рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными программами ЭКО в анамнезе /М.М. Левиашвили, Т.А. Демура, Н.Г.
Мишиева, Н.М. Файзуллина, Т.А. Назаренко, Е.А. Коган //Акушерство и гинекология. 2012. №4. С. 65-3. Лейкемия-ингибирующий фактор и рецептивность эндометрия М.М.
Левиашвили, Н.Г. Мишиева, Т.А. Назаренко, Е.А Коган //Проблемы репродукции. 2012. №3. С. 17-21.
4. Подготовка эндометрия к переносу эмбрионов в криоциклах ВРТ /М.М.
Левиашвили, Н.Г. Мишиева, Т.А. Назаренко // Врач. 2012. №5. С. 73-75.
5. Методы улучшения имплантационных свойств эндометрия в программах ВРТ /М.М. Левиашвили, Н.Г. Мишиева, Е.А. Коган, Т.А. Демура //Материалы XXI Ежегодной международной конференции Российской ассоциации репродукции человека. Санкт-Петербург, 2011. С.63-64.
6. Диагностическая ценность определения ЛИФ в цервикальной слизи /М.М.
Левиашвили, Н.Г. Мишиева, Т.А. Назаренко, Е.А. Коган, А.Н. Абубакиров, Л.А. Подрез //Материалы VI Международного Конгресса по репродуктивной медицине. Москва, 2012. С. 38-39.
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ аГнРГ – агонист гонадотропин рилизинг-гормона ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии ДВ – диагностическое выскабливание ИГХ – иммуногистохимическое исследование ИППП – инфекции, передающиеся половым путем ИФА – иммуноферментный анализ ЛИФ – лейкемия-ингибирующий фактор ЛГ – лютеинизирующий гормон ПР – рецептор к прогестерону ПЭ – перенос эмбрионов ТВП – трансвагинальная пункция УЗИ – ультразвуковое исследование р-ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ХГ - хорионический гонадотропин ЦС – цервикальная слизь чМГ – человеческий менопаузальный гонадотропин ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение ЭР – рецептор к эстрадиолу

Эмбрион может имплантироваться (внедрится в эндометрий) только в определённый очень ограниченный промежуток времени, который называется "имплантационным окном". Природа обеспечила синхронность готовности эмбриона к имплантации (5-6 день его жизни от оплодотворения) и максимальную рецептивность (возможность воспринять эмбрион) эндометрия (6-7 день после овуляции или пункции ооцитов). Но иногда это "имплантационное окно" смещается по времени вперёд или назад и тогда готовый к имплантации эмбрион не находит себе места и погибает.

Для исследования "имплантационного окна" проводится сканирующая электронная микроскопия взятого из матки эндометрия в определённые дни цикла. При определении изменений во времени формирования имплантационного окна в следующей лечебной программе (цикл ВРТ) проводится искусственная синхронизация возраста эмбриона в соответствии с готовностью эндометрия воспринять эмбрион.

Обычно при этом колят диферелин и смотрят готовность эндометрия. Чаще всего это 16-19 день 28-дневного цикла. После проведения СЕМ нужно иметь криоэмбрионы - чтобы можно было подсадить в то определннное имплатационное окно.

Для обеспечения успешной имплантации и развития эмбриона огромное значение имеет структура эндометрия, в частности содержание в нем прогестероновых и эстрогеновых рецепторов, а также пиноподий – выростов на поверхности эндометрия, к которым непосредственно прикрепляется эмбрион. Циклическое развитие эндометрия обеспечивают основные женские половые гормоны – эстрадиол и прогестерон, которые действуют на слизистую оболочку матки через собственные рецепторы. При нарушении содержания рецепторов в эндометрии и низком количестве пиноподий, даже при нормальных уровнях гормонов в крови, не происходит достаточного развития эндометрия и эмбрион не может прикрепится к матке. К сожалению, у женщин, идущих на ЭКО, именно эндометрий и бывает слабым звеном.

Метод диагностики состояния эндометрия, метод основан на комплексном изучении эндометрия, включающем гистологическое исследование, определение содержания прогестероновых и эстрогеновых рецепторов и количества пиноподий.

Для проведения данного исследования нет необходимости прибегать к болезненной и травматичной процедуре выскабливания эндометрия, требующей кратковременного наркоза. С целью получения материала для исследования, используется так называемая, аспирационная пайпель-биопсия эндометрия с помощью гибкого пластмассового катетера диаметром 3 мм с боковым отверстием на конце. Процедура занимает около 40 секунд, не требует госпитализации в стационар, обезболивания пациентки и расширения цервикального канала.

После получения результатов гистологического исследования при условии нормального ответа в следующем менструальном цикле можно проводить ЭКО и планировать беременность. При выявлении каких-либо отклонений от нормы, проводится дополнительная подготовка, которая занимает 2-3 месяца
Сравнительная характеристика гистологической структуры эндометрия и формирования пиноподий в циклах контролируемой гиперстимуляции яичников у здоровых женщин и пациенток с безуспешными программами экстракорпорального оплодотворения
И. А. Судома Т. Д. Задорожная

Изучались морфологическое состояние эндометрия и специфических маркеров рецептивности - пиноподий у здоровых женщин и пациенток с неудачами имплантации в циклах контролируемой гиперстимуляции яичников. У 95% здоровых женщин наблюдался нормальный эндометрий и нормальное развитие пиноподий. У пациенток с безуспешными циклами ЭКО имелись нарушения гистологической структуры эндометрия и числа пиноподий (отсутствие, единичные, редкие), динамики роста и времени возникновения пиноподий (остановка развития, раннее и, в основном, позднее созревание). Выявленные аномалии морфологической структуры эндометрия и формирования пиноподий могут приводить к нарушению эмбрионально-эндометриального взаимодействия и усложняют или делают невозможной имплантац


Результативность циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), несмотря на более чем двадцатилетнюю историю интенсивного развития метода, остается недостаточно высокой [1, 10, 16]. Частота наступления беременности в результате программ ЭКО колеблется от 10 до 60% для разных групп пациентов и редко превышает 30% границу [2]. Высокие уровни оплодотворения гамет продолжают контрастировать с относительно низкой частотой имплантации, что скорее всего связано с проблемами рецептивности эндометрия [16].Как ни странно, в сравнении с другими тканями организма эндометриальный эпителий представляет собой наибольший барьер для имплантации. Эмбрион может имплантироваться только в течение непродолжительного периода, во время которого эндометрий претерпевает анатомические и молекулярные изменения, необходимые для нидации эмбриона [8, 35]. Результатом исследований A. Psychoyos на животных моделях [28, 30] было показано, что имплантация происходит только тогда, когда эндометрий под влиянием гормональных воздействий достигает рецептивной фазы. Эта стадия, «имплантационное окно», является непродолжительной (до 48 ч) [17, 19, 21] и должна совпадать с развитием эмбриона до стадии бластоцисты [20, 21, 23, 29]. У крыс фаза рецептивности эндометрия характеризуется формированием характерных выбуханий апикальной части эпителиальных клеток [30-32]. Мембраны этих клеток теряют микроворсины и формируют гладкие образования, которые, как было определено, принимают участие во всасывании внутриматочной жидкости, в связи с чем были названы пиноподиями [3, 4, 28]. Такие изменения эпителиальных мембран в течение «имплантационного окна» происходят у многих (всех исследованных) млекопитающих. Пиноподии также образуются в эндометрии у женщин и могут использоваться как маркер рецептивности [10, 24, 31].Исследования последних лет показали, что нефизиологические уровни эстрогенов и, возможно, других гормональных и негормональных факторов (цитокины, хемокины и др.), которые достигаются в циклах ЭКО, могут оказывать повреждающее действие как на морфологическую структуру эндометрия, так и, возможно, на формирование пиноподий [9, 33, 36]. Правда, данные, приводимые в этих исследованиях, достаточно противоречивы и неоднозначны [5]. Цель работы - исследование гистологической структуры эндометрия и характера формирования пиноподий у здоровых женщин и пациенток с безуспешными циклами ЭКО после контролируемой гиперстимуляции яичников (КГЯ) [5].Работа является частью плановых научно-исследовательских работ кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии КМАПО по теме "Лечение эндометриоза и реабилитация генеративной функции у женщин" (2001 г.): (ИПТ 47.1 Шифр 0101И000235; УДК 618.14-002-085).Материал и методыОбследована 31 женщина, у которых было как минимум два безрезультативных цикла ЭКО и которым было перенесено не менее 2 эмбрионов хорошего качества в каждом цикле (1-я группа), и 20 здоровых доноров ооцитов (контрольная, 2-я группа) с подтвержденной фертильностью (хотя бы одни физиологические роды в анамнезе). Возраст пациенток 1-й группы колебался от 22 до 50 лет (32,3±0,58 года), пациенток 2-й группы - от 21 года до 33 лет (27,4±0,67 года). Всем женщинам проводилась КГЯ (Гонал-F, Метродин-ВЧ - Сероно, Швейцария) на фоне подавления функции яичников агонистами ГнРГ (Супрефакт-Авентис, Великобритания) по длинному лютеиновому протоколу. Хорионический гонадотропин (ХГ) в дозе 5000-10 000 ЕД вводился по достижении лидирующими фолликулами размеров 17-18 мм. У пациенток 1-й группы проводилась криоконсервация полученных эмбрионов. Поддержка лютеиновой фазы выполнялась вагинальным прогестероном (утрожестан, Бесин-Исковеско, Франция) со дня аспирации ооцитов в суточной дозе 300 мг. Следующий день после назначения ХГ считался днем пика ЛГ и маркировался как ЛГ0. День аспирации ооцитов считался ЛГ+1. Всем женщинам проводилась двойная биопсия эндометрия в лютеиновой фазе цикла на ЛГ+6/7 и ЛГ+8/9 дни. Материал для биопсии брали эндометриальным аспиратором (Wallace, Великобритания) с передней и задней стенок полости. Материал отмывался от крови в физиологическом растворе и делился на две части. Одна из них погружалась в 2,5% раствор глутарового альдегида на фосфатном буфере и выдерживалась так 24 ч, затем этот материал фиксировался в 4% растворе осмия на фосфатном буфере, дегидратировался раствором ацетона на дистиллированной воде в возрастающих концентрациях (от 20 до 100%), высушивался в углекислом газе, покрывался золотом (150-200 А). Сканирующая электронная микроскопия проводилась на микроскопе JEOL Super probe 733 с увеличением Ч2000. Оценивалось количество, качество пиноподий и время их возникновения. Стадия развития пиноподий определялась соответственно описанию G. Nikas [20], согласно которому выделялись развивающиеся, развитые (зрелые) и регрессирующие пиноподии. Функциональная природа пиноподий окончательно не определена [18, 34], но, скорее всего, они принимают непосредственное участие в адгезии бластоцисты к поверхности эндометрия. В экспериментальных работах на культуре эндометриальных клеток показано, что бластоциста позиционируется на поверхности развитых пиноподий [7]. Таким образом, развитые пиноподии должны соответствовать 5-6-му дню развития эмбриона и ЛГ +6/7 эндометрия. Поэтому мы условно считали нормой наличие развитых пиноподий на ЛГ+6/7, развивающихся - на день ЛГ+6 и регрессирующих - на ЛГ +8. Для определения числа пиноподий использовались следующие критерии: очаги пиноподий, занимавшие более 50% площади препарата, расценивались как обильные, от 20 до 50% - умеренные, менее 20% - скудные (редкие), если не определялись вообще - констатировалось отсутствие пиноподий. Вторая часть биопсийного материала погружалась в 10% раствор формалина для дальнейшего гистологического исследования. Гистологическое исследование материала проводилось на парафиновых срезах с окраской гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону. Для морфологической оценки эндометрия использовались критерии R. Noyes и соавт. [27, 28]. Статистические исследования. Статистическая обработка материала проводилась по стандартным методикам с использованием методов вариационной статистики. Полученные результаты вводились в базу данных в программе Statistica 5.0. Для оценки соотношения между параметрами использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмана. В кростабулярных таблицах для определения вероятности разницы частот признака использовался критерий Пирсона χ2 и метод максимальной вероятности (M-L) χ2.
,
,
РезультатыРезультаты гистологического исследования эндометрия представлены в табл. 1.Из табл. 1
видно, что у доноров яйцеклеток в абсолютном большинстве случаев наблюдалось нормальное строение слизистой оболочки матки, лишь у 1 женщины эндометрий не соответствовал менструальному циклу (отставал), а у 2 женщин имелось незначительное расхождение созревания желез и стромы с отставанием железистого компонента. В 1-й группе лишь у 1/3 пациенток наблюдался нормальный эндометрий. Почти у 20% (6) женщин эндометрий не соответствовал циклу, причем в 2 случаях отмечалось ускоренное развитие секреторных изменений, а в 4 - отставание. Гиперпластические процессы эндометрия наблюдались у 11 (35%) женщин, а гипопластические и атрофические изменения - у 4 (14%). Следует отметить, что у многих пациенток с гиперпластическими процессами, гипопластическим, атрофическим и даже нормальным эндометрием выявлялись очаги склерозирования стромы и стенок сосудов стромы. Таким образом, в группах доноров ооцитов и пациенток с безуспешными циклами ЭКО наблюдалась достоверная разница в гистологической структуре эндометрия. Число пиноподий и их распределение в образцах эндометрия в 1-й и 2-й группах представлены в табл. 2
.Из табл. 2 видно, что по количественным характеристикам пиноподий 1-я и 2-я группы достоверно различаются. Так, в контрольной (2-й) группе у всех пациенток отмечалось большое или умеренное количество пиноподий (рис. 1
). А у женщин 1-й группы почти в половине случаев имело место уменьшение количества пиноподий в исследуемом материале (рис. 2
). Так, пиноподии не визуализировались в 2 (6,5%) случаях, единичные пиноподии встречались в 2 (6,5%) случаях, скудные - в 10 (32,3%), скудные и неравномерные - в 2 (6,5%). Еще в 8 (25,8%) случаях количество пиноподий было нормальным, но они были крайне неравномерно распределены в биопсийном материале. Неизвестно, имеет ли такая особенность какое-либо клиническое значение, но можно предположить, что у бластоцисты уменьшаются шансы попасть в нужное для имплантации место. Возможно также, что неравномерное распределение очагов роста пиноподий связано с погрешностями в получении материала для биопсии. Известно, что наибольшее количество пиноподий располагается в верхних двух третях полости матки [7]. Т.е. если материал для исследования был взят из нижней трети, то в нем будет меньше или не будет вообще пиноподий. Но, учитывая то, что в контрольной группе таких случаев не наблюдалось, более вероятно, что неравномерность, также как и уменьшение количества пиноподий, является реальностью у пациенток 1-й группы. Время возникновения развитых (зрелых) пиноподий у обследованных женщин представлено в табл. 3
.В табл. 4
представлена динамика роста пиноподий в 1-й и 2-й группах.Из табл. 3 и 4 видно, что во 2-й (контрольной) группе у большинства пациенток - у 13 (65%) отмечалось нормальное по времени развитие пиноподий. Только у 1/3 здоровых женщин - у 7 (35,5%) обнаруживалось отставание появления развитых пиноподий. Что касается женщин 1-й группы, то нормальные временн€ые рамки развития пиноподий наблюдались лишь у 3 (9,7%), остановка развития (пиноподии в одинаковом состоянии в обеих биопсиях на ЛГ+6/7 и ЛГ+8/9) - у 9 (29,0%), из них у 5 женщин были редкие и единичные пиноподии. Отставание пиноподий отмечалось у 15 (48,4%) пациенток, более раннее развитие - у 2 (6,5%) женщин. Следует отметить, что в группе пациенток с отставанием развития пиноподий могли быть и женщины с остановкой развития пиноподий, которая не была диагностирована: в первой биопсии пиноподии не выявлялись, во второй были в стадии развития (развивающиеся), а дальнейшую их судьбу мы не отслеживали.Таким образом, существует достоверная разница в числе и качестве пиноподий в эндометрии женщин 1-й и 2-й групп. Практически во всех случаях в контрольной (2-й) группе наблюдалось нормальное по количеству и качеству развитие пиноподий, выявлялась лишь относительная патология - отставание появления развитых пиноподий у 7 (35%) пациенток. Обсуждение результатовИз представленного материала следует, что у здоровых женщин КГЯ практически не оказывает негативного влияния на морфологическую структуру эндометрия. Эти данные несколько противоречат сообщениям ряда авторов о том, что КГЯ вызывает ускорение секреторной трансформации эндометрия [13-16, 34, 37]. Так, F. Ubaldi и соавт. [38] отмечали наличие ускоренного развития секреторных изменений в эндометрии у 100% женщин, которым проводилась КГЯ, J. Garcia и соавт. [16], A. Lass и соавт. [17] - у 35%. Что касается пациенток с безуспешными циклами ЭКО, то у большинства из обследованных женщин определялись какие-либо патологические процессы в эндометрии, но лишь у 2 из них выявлялась акселерация секреторных изменений. Возможно, эти несоответствия данным литературы связаны с тем, что обследовались разные группы женщин с разной исходной патологией. Насколько нам известно, здоровые женщины и женщины с неудачами имплантации в указанных выше работах не были задействованы. В то же время асинхронизация развития стромального и железистого компонентов эндометрия выявлялась у части женщин (у 6) и контрольной (2-й) и в 1-й группе. Такие изменения в слизистой оболочке матки находили и другие авторы [6, 17]. Клиническое значение асинхронного развития секреторных изменений в эндометрии трудно определить. Так, A. Lass и соавт. [17], изучив состояние эндометрия у женщин в лечебных циклах ЭКО в день взятия ооцитов, отметили, что асинхронное развитие железистого и стромального компонентов эндометрия не оказывает негативного влияния на частоту наступления беременности. Что касается другой патологии, а именно гиперпластических, гипопластических и атрофических процессов, которые достоверно чаще встречались у пациенток 1-й группы в сравнении со 2-й, то, на наш взгляд, эта патология снижает имплантационный потенциал эндометрия. Такая точка зрения находит подтверждение и в работах других исследователей [33].Нами также были обнаружены достоверные различия в формировании пиноподий у женщин 1-й и 2-й групп. В 1-й группе наблюдались такие аномалии, как отсутствие пиноподий, скудный рост, временной сдвиг появления зрелых пиноподий в сторону как опережения, так и отставания, отсутствие (остановка) развития пиноподий. В литературе имеются данные о том, что отсутствие пиноподий или скудные пиноподии являются негативным предиктором наступления беременности [24]. Лишь в единичных работах изучалось влияние гормональных препаратов на процесс формирования пиноподий. Так, считается, что индукция овуляции может ускорять развитие пиноподий по аналогии с секреторными изменениями эндометрия [11, 12, 17, 22, 25]. В наших исследованиях только у 2 женщин 1-й группы мы обнаружили ускорение развития пиноподий на 1 сут (в первой биопсии выявлялись уже пиноподии в стадии регрессии). У большинства же пациентов со смещением «имплантационного окна» отмечалось его запаздывание. Кроме того, у достаточно большой группы пациенток пиноподии в первой и второй биопсиях находились в стадии развития. Мы назвали такое состояние остановкой развития пиноподий. Насколько нам известно, такой феномен не описан в литературе. Мы не считаем возможным объяснить это явление артефактами получения, обработки материала или погрешностями трактовки препаратов эндометрия, так как в группе доноров яйцеклеток мы ни в одном случае не наблюдали такой картины. По-видимому, остановку развития следует считать патологией формирования пиноподий, характерной для женщин с неудачами имплантации. К сожалению, из-за небольшого числа пациенток в подгруппах с различной морфологической структурой эндометрия, мы не смогли провести корреляцию между различными морфологическими состояниями слизистой оболочки матки и характером формирования пиноподий. Однако можно сказать, что у женщин 1-й группы с гистологически нормальным эндометрием встречались аномалии формирования пиноподий, такие как ускорение и отставание в развитии, скудное количество, остановка развития. С другой стороны, у пациенток с нормальным формированием пиноподий отмечались гиперпластические процессы (правда, очагового характера) в слизистой оболочке матки. Кроме того, у всех пациенток с выраженной гипотрофией и атрофией эндометрия отмечалась патология формирования пиноподий в виде их отсутствия (рис. 3
), скудного количества, остановки развития. Выводы1. У здоровых женщин КГЯ не вызывает существенных изменений в морфологической структуре эндометрия и формировании пиноподий.2. У большинства пациенток с безуспешными циклами ЭКО отмечаются изменения как в морфологической структуре эндометрия, так и в формировании пиноподий.3. Пиноподии в циклах КГЯ появляются в секреторной фазе цикла на ЛГ+5 - ЛГ+10 дни.4. У здоровых женщин (доноров яйцеклеток) во всех случаях выявляется умеренный или обильный рост пиноподий.5. У здоровых женщин в большинстве случаев (65%) зрелые пиноподии выявляются на ЛГ+6 и ЛГ+7 дни цикла.6. У пациенток с повторными неудачами циклов ЭКО наблюдается нарушение количества пиноподий (отсутствие, редкие, единичные), динамики роста пиноподий и времени их возникновения (остановка развития, раннее и позднее созревание).7. Клиническое значение таких изменений в морфологической структуре и формировании пиноподий у пациенток с безуспешными циклами ЭКО еще подлежит изучению, но, на наш взгляд, они приводят к нарушению процессов эмбрионально-эндометриального взаимодействия и препятствуют или затрудняют имплантацию.
Нормы толщины эндометрия для 28 дневного цикла
1 - 2 день цикла - 0,5 - 0,9 см
3 - 4 день цикла - 0,3 - 0,5 см
5 - 7 день цикла - 0,6 - 0,9 см
8 - 10 день цикла - 0,8 - 1,0 см
11 - 14 день цикла - 0,9 - 1,3 см
15 - 18 день цикла - 1,0 - 1,3 см
19 - 23 день цикла - 1,0 - 1,4 см
24 - 27 день цикла - 1,0 - 1,3 см
Диаметр фолликула на
*10-й день цикла — 10 мм,
*на 11-й день — 13,5 мм,
*на 12-й день — 16,6 мм,
*на 13-й день — 19,9 мм,
*на 14-й день — 21 мм (пик Овуляции)
Все дружно делаем зарядку!!!
Если плохо растет эндометрий:
Упражнения сидя.
1. Скрестите ноги по-турецки, руки положите на бедра, спина прямая. Втяните "в себя" мышцы тазового дна, ягодицы, живот. Крепко сжимайте мышцы, затем расслабьте. Повторить 16-20 раз. Упражнение тренирует мышцы и связки малого таза, влагалища и матки, улучшает кровообращение и отток венозной крови от органов малого таза.
2. Ноги выпрямлены и максимально разведены в стороны. Поднимите руки вверх на вдохе, затем сделайте наклон к носкам, потянитесь к ним, прижав голову подбородком к ямочке между ключиц. Сделайте 6-8 наклонов. Упражнение укрепляет тазобедренные суставы, препятствует отложению жировой ткани на бедрах, улучшает кровоснабжение половых органов, прямой кишки и мочевого пузыря.
3. Сядьте на пятки, спина прямая, ноги согните в коленях, руки сцепите сзади в замочек. Правую руку заведите за плечо, левую протяните сзади навстречу правой. Повторите упражнение, поменяв руки. Упражнение улучшает отток крови по сосудам нижних конечностей, укрепляет коленные и голеностопные суставы, развивает мышцы спины и улучшает осанку.
4. Сядьте так, чтобы одна нога была прямая, а другая согнута в колене, причем стопа подведена как можно ближе к промежности. Поднимите руки вверх и затем потяните их к носочку прямой ноги, сжимая ягодицы. Сохраняйте такое положение 6-8 секунд. Повторите, поменяв ноги. Проделайте упражнение 4 раза с каждой ногой. Оно улучшает кровообращение органов малого таза, устраняет запоры и застой крови в малом тазу, улучшает функцию яичников.
Упражнения лежа.
1. Лягте на спину, руки вдоль тела, ноги прямые. Поднимите одну прямую ногу вверх, затем присоедините к ней другую, поработайте ногами как ножницами - скрестно, затем опустите их вниз. Повторите упражнение 8 раз. Улучшается кровообращение органов малого таза, укрепляется мышечный корсет (мышцы брюшного пресса и поясницы).
2. Лежа на спине, поднимите ноги под прямым углом. Одну ногу положите на пол в сторону, затем присоедините к ней другую. Потом возвращайтесь в исходное положение и повторите упражнение в другую сторону. Упражнение обеспечивает максимальный венозный сброс по сосудам нижних конечностей, укрепляет мышечный корсет и боковые мышцы нижней части тела.
3. Лежа на животе, положите лоб на пол. Руки сцеплены в замок, кисти положите на локоть, руки над головой. Поднимайте разведенные в стороны прямые ноги вверх как можно выше, носочки вытянуты. Задержитесь в таком положении на 6-8 секунд. Упражнение улучшает обменные процессы, укрепляет мышцы и органы малого таза, стимулирует выработку половых гормонов, увеличивает половую активность.
Со стеной:
Упражнение № 1
1. Лягте на спину около стены или шкафа, поднимите сомкнутые вместе ноги и упритесь ими в стену.
2. Теперь опустите согнутую в колене левую ногу так, чтобы вы могли ее легко обхватить, и начинайте растирать и массировать ногу от ступни до бедра. Повторите на левой ноге 10 раз.
3. Проделайте то же самое с правой ногой, начиная всегда со ступни и продвигаясь вверх к бедру, еще 10 раз.
Упражнение № 2
1. Лягте на спину, вытяните руки вдоль бедер и плотно прижмите ладони к полу. Плавно приподнимите ноги и, упираясь ладонями рук, постарайтесь приподнять над полом талию и бедра. Задержитесь на секунду в таком положении.
2. Теперь плавно отведите ноги как можно дальше за голову и задержитесь в этом положении несколько секунд. Дыхание свободное.
3. Не сгибая колени, попытайтесь пальцами сомкнутых ног коснуться пола за головой. Оставайтесь несколько секунд в этом положении, затем, слегка расслабив ноги в коленях, плавно опускайте ноги и туловище, не отрывая головы от пола. Для этого напрягите шейные мышцы, а ладонями рук упритесь в пол. Когда талия и бедра коснутся пола, вновь выпрямите ноги, опустите их на пол и расслабьтесь. В начале занятий оставайтесь в конечной позиции 3 несколько секунд, постепенно доведите это время до 1 мин.

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ:
АСПЕКТЫ РЕАБИЛИТАЦИИ И ВОССТАНОВИТЕЛЬНОГО ЛЕЧЕНИЯ

http://www.gniik.ru/files/sbornik_mterialov_lpk.pdf

Реабилитация репродуктивной функции после
миомэктомии

http://www.volgmed.ru/uploads/dsovet/autor..._anatolevna.pdf

Ультразвуковая диагностика беременности малого срока

http://barto-clinic.ru/page/page37.html

...................

Дни рождения хочушек

Январь
2-Casablanca (Олеся)
4-solnca_svet (Лена)
Февраль
11 - KRIS (Кристина)
Март
16-Юльсон (Юля)
26-Irisochka (Ирина)
Апрель
Май
25-выдрик
Июнь
Июль
Август
14-Чизкейк (Ирина)
29-shine_diamonds
30-Настурция (настя)[/b]
Сентябрь
6-Ундина (Елена)
21-bir (Оля)
Октябрь
7-Sheka (Катя)
13-Дилайла (Лена)
29 Присцилла (Юля)
Ноябрь
24-poetessa (Таня)
Декабрь
11-Хельга (Оля)

Хочушки, ставшие уже мамочками

Анюточка - Аксинья 02.09.12
***Юля*** - Максим 22.01.2013
Виталия - Кирилл 26.01.13
Диня- Валентина 03.04.2013
Ivanka- Платон 08.04.2013
Улисенок - Варенька 17.06.13
Котофеевна - Миша 10.07.2013
Мишель - Аврора 15.09.2013
zeus-Софья 01.10.13
Марфушка - Анастасия 25.12.13
Мармеладка - Илья 28.01.14
Улыбка - Екатерина 02.04.14
Юлик - Серафима 11.06.14
Aloha - Вера 18.06.2014
Lenk@Hudenko- Рома 04.07.14
KruglashOK - Рома 19.08.14
Ким - Дарья 11.09.14
СаниПоллин - Аришка 04.10.14
Масичка - Александр 09.10.14
Лёлька13 - Святослав 4.12.2013

[Куня 0]

Урааааа!!!!! Новый дом!!!!! Пусть он будет не таким долгим как предыдущий, а главное пусть будет очень очень счастливым и плодотворным!!!!

 

Ой и картиночка у нас новая))

Изменено 14 марта 2017 пользователем Куня

[Куня 0]

БабкаЁжка, 25 лет, только вышла замуж, детей нет.......я нафиг никому не нужна!!!!

[Хельга 0]

УРА))) С новым домиком, пусть у нас уже тут у всех получится, и пусть этот домик будет самый плодотворный за всю историю ВМ)))

Куня, что то странное клеймо, конечно работодателю неприятно всё это дело с декретами, но отказывать только по этой причине прям подозрительно.

На моём опыте-29.08 поженились, а в начале октября, т.е. через месяц (тут работодатель даже мог бы подумать что я уже Б) я искала работу, взяли в Банк, правда у них срочный договор (увольняюсь после рождение ребенка)но тоже спрашивали не собираюсь ли я в декрет. Дочка вышла в садик, я опять пошла искать работу, и опять всё тот же вопрос-самый оптимальный возраст между детишками, не планирую ли я второго, Ответ-нет, и на второй поход собеседования меня взяли. Не подвела, проработала 3,5 года почти. На этой работе даже не спрашивали, ну т.е. 1 собеседование и взяли))

[Присцилла 0]

Ура! С новым домиком нас! Нам всем плодотворной, тёплой и ласковой весны, сбычи мечт и наконец двух заветных полосочек!

[Куня 0]

УРА))) С новым домиком, пусть у нас уже тут у всех получится, и пусть этот домик будет самый плодотворный за всю историю ВМ)))

Куня, что то странное клеймо, конечно работодателю неприятно всё это дело с декретами, но отказывать только по этой причине прям подозрительно.

На моём опыте-29.08 поженились, а в начале октября, т.е. через месяц (тут работодатель даже мог бы подумать что я уже Б) я искала работу, взяли в Банк, правда у них срочный договор (увольняюсь после рождение ребенка)но тоже спрашивали не собираюсь ли я в декрет. Дочка вышла в садик, я опять пошла искать работу, и опять всё тот же вопрос-самый оптимальный возраст между детишками, не планирую ли я второго, Ответ-нет, и на второй поход собеседования меня взяли. Не подвела, проработала 3,5 года почти. На этой работе даже не спрашивали, ну т.е. 1 собеседование и взяли))

 

Оль ну значит тебе повезло)))) или просто раньше все равно не так было как щас - все таки с твоего декрета 7 лет прошло))))

Я 2 года назад на работе вместе с отделом кадров искала человека себе в отдел и мы тоже на всех так же клеймо вешали... Сейчас я сама метаюсь.....и подружка у меня сейчас меняет место работы - тоже никому не нужна, на ней такое же клеймо((.... И как бы я не отмазывалась что ребенка не планирую - видимо никто не верит....

[Хельга 0]

Оль ну значит тебе повезло)))) или просто раньше все равно не так было как щас - все таки с твоего декрета 7 лет прошло))))

Я 2 года назад на работе вместе с отделом кадров искала человека себе в отдел и мы тоже на всех так же клеймо вешали... Сейчас я сама метаюсь.....и подружка у меня сейчас меняет место работы - тоже никому не нужна, на ней такое же клеймо((.... И как бы я не отмазывалась что ребенка не планирую - видимо никто не верит....

 

 

Ну просто клеймо ставить только по причине что замуж вышла недавно-далеко не правильно, только по той причине что такое дело не подгадаешь, многие выходят замуж и ещё живут для себя, а для кого то раз и неожиданность случается, даже когда не планируешь. Так что.

И вроде работодатель ничего не теряет всякие выплаты выплачивает ФСС. Что теряет? что придется искать нового сотрудника, так тут и без декрета очень много случаев что народ прыгает с места на место, сама сейчас просматриваю резюме и чуть ли не 50 % потенциальный сотрудников прыгают с работы на работу через какие то 4-8 мес, прям закономерность какая то.

Вот как раз ли я больше внимание обращала при выборе персонала на усидчивость человека на рабочем месте (т.е. продолжительность работы на предыдущих местах)

Изменено 14 марта 2017 пользователем Хельга

[БабкаЁжка 0]

БабкаЁжка, 25 лет, только вышла замуж, детей нет.......я нафиг никому не нужна!!!!

Аааа, ну такие у многих есть) Мне 30 почти один есть, скоро за вторым пойдете. Потом " ааа, у вас двое детей, значит больничные постоянно будут" А потом уже скоро пенсия

[Casablanca 1]

С двумя спрашивают, а третьего вы не планируете. Конечно нет, так я тебе и рассказала все)))

[GalinkaSch 1]

Меня тоже постоянно спрашивали не уйду ли в декрет, я говорила что не планирую, но и гарантировать не могу, и брали скрепя сердцем, я не подводила уходом в декрет, но всё равно соскакивала периодически в другую фирму! А что делать когда по несколько месяцев не платят зарплату? Я не знаю как тут отличаться усидчивостью))) И да меня часто спрашивали почему меняла работу, отвечала честно - не платят потому что!!! Вот я хочу в декрет ещё в один сразу сходить чтобы дать себе ещё 3 года подумать "хочу ли я вернуться на прежнее место работы"))))

Это не главная цель конечно, основная - хочу небольшую разницу между детьми, пусть мне будет тяжело, т.к. на помощь я не рассчитываю, но для деток лучше, мне так кажется! Ну и тяжело будет по началу, потом легче! А там может и для 3-его останется время! А то если по 10 лет промежутки растягивать - можно так ничего и не успеть!

 

Изменено 14 марта 2017 пользователем GalinkaSch

[БабкаЁжка 0]

GalinkaSch, я вот жалею иногда что раньше за вторым не собралась. Реально сыну скучно одному(((

[Casablanca 1]

А меня устраивает разница в возрасте дочек, третий с еще большей разницей будет между второй и им, а уж со старшей вообще молчу - 14лет)))

[Irisochka 2]

Иринка, чего там про разницу в 10-11 лет... На кладбище ползти, завернувшись в простыню... Не... ну я ползу, болею 2-ю неделю. Останусь без глюкозного теста похоже

[GalinkaSch 1]

Иринка, чего там про разницу в 10-11 лет... На кладбище ползти, завернувшись в простыню... Не... ну я ползу, болею 2-ю неделю. Останусь без глюкозного теста похоже

Это ты мне?))))) Я вообще ничего не имею против возраста мамы или разницы между детьми, тут каждому своё, как говорится))) Я чисто про себя, ну не хочу я после - 35 рожать, в идеале после 30 даже, чтоб как раз никуда не ползти :very_funny: , могу ведь хотеть?)))) И как по мне, я б вообще погодок в идеале родила, но уже опоздала)

 

А ты чего это разболелась????

 

Меня мама кстати отговаривает от второго... вот те на))) Короче мир для меня поделился на двое, одни считают что ещё рано, дочка маленькая, другие что и одного хватит! Моё мнение не учитывается видимо)

Изменено 14 марта 2017 пользователем GalinkaSch

[Irisochka 2]

Это ты мне?))))) Я вообще ничего не имею против возраста мамы или разницы между детьми, тут каждому своё, как говорится))) Я чисто про себя, ну не хочу я после - 35 рожать, в идеале после 30 даже, чтоб как раз никуда не ползти :very_funny: , могу ведь хотеть?)))) И как по мне, я б вообще погодок в идеале родила, но уже опоздала)

 

А ты чего это разболелась????

 

Меня мама кстати отговаривает от второго... вот те на))) Короче мир для меня поделился на двое, одни считают что ещё рано, дочка маленькая, другие что и одного хватит! Моё мнение не учитывается видимо)

Я тоже всё таки хотела до 35 уложиться. Ну, если бы не уложилась, думаю, ничего бы не изменилось.

Ну, вот так получилось. Всю зиму продержалась и вот...

А твоя мама свободы вкусила, и вспомнила, как был с 3-мя детьми, поэтому и отговаривает. Но у каждого своя жизнь. Меня не отговаривали, а чуть ли не приказывали и у виска крутили.

[Куня 0]

А меня устраивает разница в возрасте дочек, третий с еще большей разницей будет между второй и им, а уж со старшей вообще молчу - 14лет)))

 

 

У меня с сестрой разница 14 лет.....для мамы это полный кайф!!! Она можно сказать живет своей жизнью.....а для меня эта больше дочь а не сестра((( я смотрю сейчас на маму, на мужа...у них есть именно сестры, они постоянно о чем то болтают, делятся своей жизнью, советуются и тд..... А у меня с сестрой именно отношения мать-дочь.....а мне так хочется иногда с ней чем то поделиться ли посоветоваться, и хочется чтобы со мной она откровеничала.....

[Куня 0]

Ну просто клеймо ставить только по причине что замуж вышла недавно-далеко не правильно, только по той причине что такое дело не подгадаешь, многие выходят замуж и ещё живут для себя, а для кого то раз и неожиданность случается, даже когда не планируешь. Так что.

И вроде работодатель ничего не теряет всякие выплаты выплачивает ФСС. Что теряет? что придется искать нового сотрудника, так тут и без декрета очень много случаев что народ прыгает с места на место, сама сейчас просматриваю резюме и чуть ли не 50 % потенциальный сотрудников прыгают с работы на работу через какие то 4-8 мес, прям закономерность какая то.

Вот как раз ли я больше внимание обращала при выборе персонала на усидчивость человека на рабочем месте (т.е. продолжительность работы на предыдущих местах)

 

А никому это в голову не вобьешь Оль(((( и вообще если я раньше просто говорила "не планируем", то сейчас (я так же и говорю), но уже хочется сказать "да не получается у нас, не парьтесь...и неизвестно когда получится"... Они же еще и думают что все так просто, щас я устроюсь и бах, с первого раза забеременею...

 

[Близняша 1]

,,,,

Изменено 18 мая 2017 пользователем Близняша

[Чизкейк 3]

Ну все девочки, у меня начались.Я предупреждала мужа, что у нас сразу не получится. Мы со старшими детьми по полгода- год пытались. Ну хоть на презервативах экономия, а то на месяц у нас по 1000 руб уходило.

[Хельга 0]

Девочки всем привет.

пусть наконец у всех все получится!!!!!!!!!

иду сегодня мимо ЖК, а там плакат против абортов "Подари мне жизнь!" и рыдать хочется....Подарю, конечно, только ты приди. мой малыш......

 

Придёт, придёт, у всех нас придёт))

 

Ну все девочки, у меня начались.Я предупреждала мужа, что у нас сразу не получится. Мы со старшими детьми по полгода- год пытались. Ну хоть на презервативах экономия, а то на месяц у нас по 1000 руб уходило.

 

А ну да, главное экономия же на презики :very_funny: , зато потом какая не экономия на детишек, далеко больше чем 1000 в месяц :hi-hi: (шутка))))

Хорошо мы не тратимся на презики, не нра они нам, только ППА, вроде за 13 лет не подводил))

[Чизкейк 3]

Придёт, придёт, у всех нас придёт))

 

 

 

А ну да, главное экономия же на презики :very_funny: , зато потом какая не экономия на детишек, далеко больше чем 1000 в месяц :hi-hi: (шутка))))

Хорошо мы не тратимся на презики, не нра они нам, только ППА, вроде за 13 лет не подводил))

Оля, конечно потом и траты другие, но приятные.

Вот мы и покупали дорогие и тонкие, ППА тоже пробовали, не понравилось. А другие способы мне не подходят по состоянию здоровья. Так что у нас выбора не было.

 

[Присцилла 0]

А я уже даже при всем желании не уложусь до 35(( В октябре стукнет, но тут уже не до жиру, главное, чтобы все получилось!

[БабкаЁжка 0]

А я уже даже при всем желании не уложусь до 35(( В октябре стукнет, но тут уже не до жиру, главное, чтобы все получилось!

Конечно получится! И возраст не имеет значения. Знакомая в 42 заБ с кучей диагнозов и говорили что бесплодна и из-за диагнозов на аборт ее отправляли, а она выносила и родила.

 

[БабкаЁжка 0]

Сходила сегодня на УЗИ - все у меня хорошо. Так что врач сказала в мае можно начинать

[KRIS 0]

Девочки, молчите про 35. А то совсем грусть тоска. Мне 35((( чего же мне, все теперь... Я вот себя, как и прежде на 25 ощущаю.

[Присцилла 0]

Девочки, молчите про 35. А то совсем грусть тоска. Мне 35((( чего же мне, все теперь... Я вот себя, как и прежде на 25 ощущаю.

 

Ну почему же всё??? Я например в 35 планирую первого родить))

[Casablanca 1]

Девочки, молчите про 35. А то совсем грусть тоска. Мне 35((( чего же мне, все теперь... Я вот себя, как и прежде на 25 ощущаю.

Кристинка, ты не только в душе на 25, но и внешне. Я когда увидела дату рождения твою - не поверила)

[Поня 2]

Села рядом с Присциллой, поделилась семками :good_friend:

 

Я тоже уже в 35 собираюсь первого родить)))

Изменено 15 марта 2017 пользователем Поня

[KRIS 0]

Ну вот, нас уже трое, кто в 35 родить собирается)))

[rififi 0]

У меня с сестрой разница 14 лет.....для мамы это полный кайф!!! Она можно сказать живет своей жизнью.....а для меня эта больше дочь а не сестра((( я смотрю сейчас на маму, на мужа...у них есть именно сестры, они постоянно о чем то болтают, делятся своей жизнью, советуются и тд..... А у меня с сестрой именно отношения мать-дочь.....а мне так хочется иногда с ней чем то поделиться ли посоветоваться, и хочется чтобы со мной она откровеничала.....

Ксюш, ты подожди, она постарше станет и отношения ваши с ней будут другими. И рассказывать будет, и советоваться)

[rififi 0]

так, уступите место пенсионерке :very_funny:

мне 36 будет в августе ... дочка уже есть, но хочется ещё малыша. А мне дай бог начать пробовать, а тут похоже не раньше лета ... опять наши сроки переносятся(((

[Куня 0]

так, уступите место пенсионерке :very_funny:

мне 36 будет в августе ... дочка уже есть, но хочется ещё малыша. А мне дай бог начать пробовать, а тут похоже не раньше лета ... опять наши сроки переносятся(((

 

Чего вы переживаете...сейчас очень модно рожать за 40....даже на Вуманс Дэй статью писали про наших волгоградских мам кто родил за 40.... И вообще по опыту моей мамы и еще некоторых знакомых кто родили за 35 могу сказать что мамы очень молодеют.....

 

У моей одной подружки маме 41 год и она уже несколько лет как бабушка, а млей 48 и она молодая мама.....и вот я честно скажу и в жизни та выглядит как бабушка, а моя как молодая мама, хотя разница в возрасте налицо))))

 

Рожайте первых, вторых, третьих, четвертых позже - они молодят очень!!!!

 

А еще как у меня говорили родители "Вот щас Ксюха вырастит, выйдет замуж и уйдет от нас, и что нам делать? как дальше жить? чем заниматься?, а так одна выпорхнет из гнезда, и у нас еще одна останется..."

[Хельга 0]

Девчонки, привет, вы себя в старушки-пенсионерки не записывайте, кто есть у меня в друзьях ОК ну все прекрасно и молодо выглядите)))молодцы, так держать, ну и главное в душе чувствовать себя молодой))).

 

[sleppy 0]

Чего вы переживаете...сейчас очень модно рожать за 40....

Ой, дайте пройти самой модной :very_funny: Девы, мне 42 и ничЁ, планируем.

 

Приветы всем :misc_flowers: . Мы как-то целый цикл пропустили с моими головными болями. Теперь пролечила свою головушку, заодно обследовала свой организм, все ОК. Сейчас доем свои таблетки и с нового цикла в бой. И почему-то мне кажется, что все быстро получится. Весна чтоли действует.

[Casablanca 1]

Наталька, ну хоть ты нас порадуй вестями))) должна ж болтушка заполосатиться) А вообще очень правильный настрой.

[БабкаЁжка 0]

А еще как у меня говорили родители "Вот щас Ксюха вырастит, выйдет замуж и уйдет от нас, и что нам делать? как дальше жить? чем заниматься?, а так одна выпорхнет из гнезда, и у нас еще одна останется..."

 

Правильно еще было бы продолжить " нарожает детей и будет подкидывать бабе с дедом"

Изменено 15 марта 2017 пользователем БабкаЁжка

[Клементинка 0]

У меня с сестрой разница 14 лет.....для мамы это полный кайф!!! Она можно сказать живет своей жизнью.....а для меня эта больше дочь а не сестра((( я смотрю сейчас на маму, на мужа...у них есть именно сестры, они постоянно о чем то болтают, делятся своей жизнью, советуются и тд..... А у меня с сестрой именно отношения мать-дочь.....а мне так хочется иногда с ней чем то поделиться ли посоветоваться, и хочется чтобы со мной она откровеничала.....

 

 

Ксюш, ты подожди, она постарше станет и отношения ваши с ней будут другими. И рассказывать будет, и советоваться)

 

Далеко не факт. У меня с братом разница 9 лет всего, но так уж сложилось, что я много времени с ним проводила, как чуть подрос. И то же самое наши отношения больше мать-сын напоминают. Хотя он и пытается со мной откровенничать, а у меня волосы дыбом, не хочу знать всех подробностей и переживать за него все время! Ему уже 21 ... Конечно, есть надежда, что когда станет семьянином, повзрослеет и возмужает, интересы станут схожими... Но боюсь, я тогда уже стану бабушкой)))

[Клементинка 0]

А вообще, всем привет!

 

Давно вас почитываю, писать времени особо нет..Да и нечего - мы хотим лялю, а что-то все никак(

Еще ничего не искали, не обследовали, поэтому причин не знаю. Я год назад болела и обследовалась - все хорошо было.

И вот месяцев 8 ничего не выходит. Может просто не время сейчас (оно и правда не время, но я мне кажется сложно в современном ритме сказать , что вот сейчас то самое время!))) Поэтому мы б обрадовались в любой момент.

Но я верю, что еще буду мамой!

Мне 30 , скоро уже и 31 , дочке старшей 11 , младшей 9. Никогда не нравилась большая разница в возрасте! Думала , что у меня то уж точно так не будет! Ага, конечно)))

[Клементинка 0]

Правильно еще было бы продолжить " нарожает детей и будет подкидывать бабе с дедом"

я вот уже думаю, может просто подождать еще немного и няньчиться уже с внуками?)

А вдруг мои дети будут какими-нибудь чайлдфри?! я ж принудить их не смогу... хотя можно попробовать! :very_funny:

[sleppy 0]

я вот уже думаю, может просто подождать еще немного и няньчиться уже с внуками?)

У меня так не получилось.... И внуку уже 4,2 и свою лялю хочется.